東祁連山高寒草地土壤優(yōu)良解磷細(xì)菌的研究.pdf

1、本研究根據(jù)高寒草地不同植被類型，選取了有代表性的7個(gè)樣地，即杜鵑灌叢（Rhododendron fruticosa shrub land.）、高山柳灌叢（Sslix cupularis shrubland）、金露梅高寒灌叢（Dasiphoru fruacosa shrub land）、珠芽蓼草地（Polygonumgrassland）、禾草草地（Gmss grassland）、沼澤草地（Swamp grassland）和嵩草草地（Kob

2、resia grassland）。采用微生物學(xué)方法和分子生物學(xué)方法對(duì)其表層土壤中解磷細(xì)菌進(jìn)行分離，并對(duì)其解磷能力和解磷機(jī)制進(jìn)行了初步研究，選取其中解磷能力強(qiáng)的菌株對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了探索。并采用分子生物學(xué)方法對(duì)解磷能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行了16SrDNA序列測(cè)定，確定其系統(tǒng)分類學(xué)地位。研究結(jié)果如下：
　　 1.高寒植被土壤解磷菌的篩選及解磷能力測(cè)定
　　 采用PKO培養(yǎng)基從各樣地土壤中共分離獲得解磷細(xì)菌共計(jì)36株，根據(jù)對(duì)其菌落形態(tài)

3、特征和菌體染色觀察確定菌株Y5、Y14、Y15在兩個(gè)樣地中均能分離得到，因此共計(jì)分離得到菌株33種。經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)20代，其中有20株解磷菌解磷能力明顯下降，占總解磷菌的60.61％，解磷能力喪失較嚴(yán)重，其余13株解磷菌采用解磷圈法測(cè)定D/d值，結(jié)果顯示對(duì)Ca3（PO4）2均有溶解作用，8d后D/d值在1.21～4.01之間，但溶解效果差異較大。其中解磷效果最好的（D/d值≥4）有1株，占總數(shù)的7.69％；解磷效果好的（

4、2≤D/d<4）有8株，占總數(shù)的61.54％；效果一般的（1.5≤D/d<2）有2株，占15.38％；解磷效果較差的（D/d<1.5）有1株，占7.69％。對(duì)13株解磷菌采用搖瓶培養(yǎng)定性測(cè)定其對(duì)Ca3（PO4）2的溶解能力，結(jié)果表明：菌株間解磷能力差異較大，菌株Y2解磷效果最好；其次是Y5、Y6、Y11等3個(gè)菌株，而Y20、Y21、Y28、Y15等解磷能力較弱。
　　 2.優(yōu)良解磷菌株對(duì)磷礦粉溶解能力測(cè)定
　　 從13株

5、解磷菌中選擇解磷能力較強(qiáng)的4株菌株，測(cè)定其對(duì)3種磷礦粉（磷礦粉Ⅲ、磷礦粉Ⅳ、磷礦粉ⅩⅢ）的溶解能力。結(jié)果表明：各菌株對(duì)磷礦粉Ⅳ的溶解能力普遍較好強(qiáng)，同等條件下，較磷礦粉Ⅲ要高0～3個(gè)百分點(diǎn)，而較磷礦粉ⅩⅢ要高0～7個(gè)百分點(diǎn)；各菌株均在15℃～30℃下解磷能力較好，解磷溫度范圍較寬。其中Y1在20℃對(duì)各磷礦粉溶解能力均最強(qiáng)，Y2在15℃時(shí)解磷效果最好，Y3、Y4在20℃具有最佳的解磷能力。各菌株30℃對(duì)各磷礦粉溶解能力均開始下降，35℃時(shí)

6、達(dá)到最低。
　　 采用砂培法，測(cè)定4株解磷菌對(duì)各磷礦粉釋放、儲(chǔ)存及同化情況，結(jié)果顯示：解磷菌不僅可以將轉(zhuǎn)化的磷素直接釋放到環(huán)境中，還可以將一部分磷素儲(chǔ)存在體內(nèi)作為自身磷源，另外還有部分被同化用于自身生長(zhǎng)需要。但各菌株對(duì)3種磷礦粉的釋放、儲(chǔ)存、同化量各不相同。對(duì)于磷礦粉Ⅲ和磷礦粉Ⅳ，各菌株將溶解后的磷素大部分直接釋放到環(huán)境中。而對(duì)于磷礦粉ⅩⅢ，菌株Y1、Y3、Y4將大部分溶解的磷素同化到體內(nèi)，僅有菌株Y2將溶解磷素的73.12％儲(chǔ)

7、存的在細(xì)胞內(nèi)作為自身磷源。
　　 3.解磷菌解磷動(dòng)態(tài)與解磷機(jī)制的初探及其培養(yǎng)條件篩選
　　 選擇解磷效果最佳組合即菌株Yl與磷礦粉Ⅳ的組合測(cè)定解磷動(dòng)態(tài)和解磷機(jī)制。菌株Y1在8d時(shí)，D/d值達(dá)到最大值3.94，之后D/d值不在發(fā)生較大變化，解磷效果趨于穩(wěn)定。定量測(cè)定其解磷動(dòng)態(tài)時(shí)，菌株Y1在96h后解磷效果達(dá)到最大值，培養(yǎng)液中有效磷含量高達(dá)3.995mg㎎，但總體上菌株Y1在24h～168h過(guò)程中，溶解釋放的有效磷量基本保持

8、恒定。
　　 菌株Y1溶解磷礦粉Ⅳ的解磷機(jī)制進(jìn)行初探結(jié)果顯示：菌液培養(yǎng)36h后，對(duì)照中有效磷含量為5.171㎎，酸處理中有效磷含量為7.547㎎，酶處理中有效磷含量為8.666㎎，酸和酶共同作用有效磷的含量為7.316㎎?？梢?jiàn)在解磷菌Y1溶解磷礦粉Ⅳ過(guò)程中，酶解的作用最強(qiáng)，有機(jī)酸在磷礦粉溶解過(guò)程中也起著積極的作用，且菌株Y1分解的有機(jī)酸溶解磷礦粉的能力較無(wú)機(jī)酸的溶解能力強(qiáng)。
　　 對(duì)解磷菌Y1的搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行初步篩選，

9、結(jié)果表明：菌株Y1搖瓶發(fā)酵的最佳條件為，溫度：1512～3012；培養(yǎng)基成分：玉米粉1％、養(yǎng)面1％；pH值7.5；裝液量250ml三角瓶中裝50ml。
　　 4.解磷菌的形態(tài)特征及16S rDNA的鑒定
　　 通過(guò)對(duì)解磷菌形態(tài)和染色反應(yīng)觀察，結(jié)果表明：13株分離物以革蘭氏陰性菌為多數(shù)，共計(jì)10株，占總數(shù)的76.92％。菌落形態(tài)多樣，有桿狀、短桿狀、球形、橢圓形、近球形；顏色以白色居多，多數(shù)半透明，少數(shù)菌體內(nèi)具有芽孢。對(duì)其

10、中解磷能力強(qiáng)的4株菌株，即Y1、Y2、Y3、Y4進(jìn)行16S rDNA的分子鑒定，其中Y2、Y3、Y4等3個(gè)菌株分別與Erwinia billingiae（登錄號(hào)AM055711.1）、Pseudomonasreactans（登錄號(hào)DQ257418.1）、Serratia plymuthica（登錄號(hào)EF064206.1）的同源性均為99％，因此，初步確定Y2、Y3、Y4分別為Erwinia billingiae、Pseudomonasr