稗草脅迫下水稻化感潛力變化及其分子機(jī)制.pdf

1、采用稻稗共培體系水培法，以化感水稻P1312777和非化感水稻Lemont為供體。以稗草(Echinochloa crus-galli L.)為受體，研究了不同稗草密度脅迫下化感水稻P1312777和非化感水稻Lemont的化感作用差異與分子機(jī)制。密度設(shè)置為水稻20株：稗草5株(4：1)、水稻20株：稗草10株(2：1)、水稻20株：稗草20株(1：1)三個(gè)水平，以水稻20株為水稻對(duì)照，以稗草20株為稗草對(duì)照。首先，探討了不同稗草密度脅

2、迫下稗草、水稻的形態(tài)指標(biāo)(根長(zhǎng)、株高和干物質(zhì)重)、生理生化指標(biāo)(SOD、POD、CAT、可溶性糖和可溶性蛋白)、葉片的光合作用指標(biāo)(凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、細(xì)胞間隙CO2濃度、氣孔限制值和葉綠素含量)以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)(N、P、K)吸收與利用效率。第二，采用抑制消減雜交技術(shù)(suppressionsubtractive hybridization.SSH)，分析了稻稗密度為1：1時(shí)，不同化感滯力水稻響應(yīng)稗草脅迫的基因表達(dá)差異。第三，采用

3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技術(shù)，對(duì)不同密度稗草脅迫下兩種水稻葉片、根系中酚類代謝途徑的7個(gè)關(guān)鍵酶(苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶、羥化酶、輔酶A連接酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、肉桂酰輔酶A和肉桂酸脫氫酶)和萜類代謝途徑的7個(gè)關(guān)鍵酶(HMG輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、單萜烯環(huán)化酶、倍半萜烯環(huán)化酶、二萜烯環(huán)化酶、八氫番茄紅素合成酶和角鯊烯

4、合成酶)的基因表達(dá)行為做了分析，并采用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)了水稻葉片、根系和根系分泌物中酚酸類物質(zhì)含量，采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜(GC/MS)檢測(cè)了水稻根系分泌物中萜類物質(zhì)含量。最后，根據(jù)萜類物質(zhì)抑草活性篩選結(jié)果，選擇了5種含氧萜類化合物，即(-)-香芹醇(C10H16O)、(+)-香芹酮(C10H14O)、(-)-薄荷酮(C10H18O)、(-)-香芹基乙酸酯(C12H18O2)和(+)-雪松醇(C15H26O)，按照5因子的正交旋轉(zhuǎn)

5、回歸設(shè)計(jì)進(jìn)行抑草作用最優(yōu)組合配比試驗(yàn)，并對(duì)獲得的萜類最優(yōu)組合溶液進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室和田間抑草驗(yàn)證。
　　 研究的主要結(jié)果有：
　　 1.在稻稗共培體系，兩種水稻都對(duì)伴生稗草的生長(zhǎng)有抑制作用，且隨著稗草密度增大，抑制作用增強(qiáng)。但化感水稻對(duì)稗草生長(zhǎng)的抑制率顯著高于非化感水稻，以密度1：1為例，P1312777對(duì)稗草根長(zhǎng)、株高和干物質(zhì)重的抑制率分別為63.66％、54.47％和46.71％，而Lemont分別為31.56％、20.1

6、9％和24.34％。通過(guò)化感競(jìng)爭(zhēng)分離法對(duì)共培體系中化感作用和資源競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行分離，數(shù)據(jù)表明：P1312777中化感作用對(duì)稗草根長(zhǎng)的抑制率分別為39.06％(密度4：1)、40.88％(密度2：1)和49.39％(密度1：1).而Lemont分別為9.57％(密度4：1)、8.36％(密度2：1)和-3.19％(密度1：1)。稻-稗之間的競(jìng)爭(zhēng)分析表明，P1312777對(duì)稗草的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用是Lemont的2倍多，稗草對(duì)P1312777為競(jìng)爭(zhēng)促進(jìn)

7、作用，對(duì)Lemont為競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。結(jié)果揭示了兩種水稻在稗草脅迫下的生存策略不同，化感水稻P1312777是以不斷加大化感抑草作用為主，而非化感水稻Lemont以不斷增強(qiáng)資源競(jìng)爭(zhēng)為主。P1312777在稻稗共培體系中具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。
　　 2.與水稻共培的稗草，其葉片和根系中SOD、CAT、POD、可溶性糖和可溶性蛋白均顯著下降，且隨稗草密度加大，各指標(biāo)的抑制率升高。但化感水稻的抑制率顯著高于非化感水稻，以密度1：1為例，P

8、1312777對(duì)上述指標(biāo)的抑制率分別為36.39％、50.93％、48.29％、33.14％和51.74％，而Lemont分別為7.33％、22.30％、12.82％、6.18％和10.24％。稗草葉片中葉綠素含量也隨密度增大而降低，P1312777對(duì)稗草葉片葉綠素含量的抑制率分別為26.52％(密度4：1)、31.69％(密度2：1)和41.29％(密度1：1)，而Lemont分別為4.14％(密度4：1)、6.49％(密度2：1)和

9、11.11％(密度1：1)。上述生理指標(biāo)的表現(xiàn)與形態(tài)學(xué)指標(biāo)保持了一致的結(jié)果。與P1312777共培的稗草對(duì)N、P、K的吸收效率和利用效率都隨稗草密度增大而降低，而與Lemont共培的稗草對(duì)N、P、K的吸收效率隨稗草密度增大而降低，但其利用效率卻反而不斷上升。這反映了P1312777不僅影響了稗草對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，而且分泌的化感物質(zhì)干擾了稗草的內(nèi)部代謝機(jī)制，抑制了其營(yíng)養(yǎng)利用效率，兩
　　 個(gè)水稻品種對(duì)稗草的抑制機(jī)理不同。
　　

10、 3.SSH分析結(jié)果表明：稗草脅迫下，P1312777根系中增強(qiáng)表達(dá)基因涉及化感物質(zhì)代謝、植物生長(zhǎng)及細(xì)胞周期相關(guān)、脅迫防御與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)代謝。其中4-香豆酸輔酶A連接酶是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶之一，此基因增強(qiáng)表達(dá)暗示P1312777能夠調(diào)節(jié)根系酚酸類化感物質(zhì)代謝強(qiáng)度，以合成更多的酚酸類化感物質(zhì)，增強(qiáng)水稻的抑草潛力能力。而細(xì)胞色素P450單氧化酶的表達(dá)增強(qiáng)，表明了P1312777需要提供更多的的細(xì)胞色素合成的底物—萜類物質(zhì)，以合成更多的植

11、物激素和防御物質(zhì)。
　　 4.qRT-PCR結(jié)果表明：稗草脅迫下P1312777葉、根中與酚類代謝途徑相關(guān)的7個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，上調(diào)倍數(shù)隨著稗草密度加大而增大。在Lemont中只有第一個(gè)酶即苯丙氨酸解氨酶上調(diào)表達(dá)(但上調(diào)倍數(shù)遠(yuǎn)小于P1312777)，其余的酶都下調(diào)表達(dá)；HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照比較，脅迫下兩種水稻葉片、根系和根系分泌物中酚酸類含量隨著稗草密度加大而上升。但是P1312777葉、根和根系分泌物中的酚酸類含最(以密

12、度1：1為例)分別比Lemont高3.76、3.27和4.59倍。兩種水稻的葉、根中與萜類代謝相關(guān)的7個(gè)基因均上調(diào)表達(dá)，上調(diào)倍數(shù)隨著稗草密度加大而增大。但P1312777上調(diào)倍數(shù)遠(yuǎn)大于Lemont。GC/MS檢測(cè)結(jié)果表明，P1312777根系分泌物中萜類物質(zhì)相對(duì)含量是Lemont的1.5倍。其中水溶性好、抑草活性高的含氧萜類化合物占總成分的85％以上。
　　 5.選擇5個(gè)室內(nèi)生測(cè)抑草活性較高的含氧萜類物質(zhì)，通過(guò)5因子的正交旋轉(zhuǎn)回

13、歸設(shè)計(jì)，得出最優(yōu)組合濃度為(-)-香芹醇0.033mmol·L-1、(+)-香芹酮0.03 mmol·L-1、(-)-薄荷酮0.08mmol·L-1、(-)-香芹基乙酸酯0.02mmol·L-1和(+)-雪松醇0.001mmol·L-1，理論抑制率為93.69％。室內(nèi)生測(cè)法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)預(yù)萌發(fā)的稗草在該萜類最優(yōu)組合溶液中不能正常生長(zhǎng)。水培種植試驗(yàn)結(jié)果表明。與對(duì)照比較。萜類最優(yōu)組合溶液對(duì)稗草根長(zhǎng)、株高和干物重的抑制率分別為69.60％、23.9

14、3％和.58.24％，對(duì)柳草葉片中的SOD、POD、CAT的抑制率分別為59.49％、58.05％和74.86％，對(duì)稗草根系中的SOD、POD、CAT的抑制率分別為76.79％、78.54％和74.23％。土培種植試驗(yàn)結(jié)果表明，單一植物種植時(shí)，萜類最優(yōu)組合溶液對(duì)稗草的根長(zhǎng)、株高、干重的抑制率分別為48.58％、28.11％、39.88％。對(duì)所選擇的常規(guī)水稻明恢63、汕優(yōu)63的根長(zhǎng)、株高、干重基本不影響。稻稗共培體系下，萜類最優(yōu)組合溶液對(duì)

15、水稻和稗草的影響趨勢(shì)與單種模式下的結(jié)果基本一致，即稗草受到明顯抑制，而水稻基本不受影響。田間模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萜類最優(yōu)組合溶液處理后，12種自然產(chǎn)生的稻田雜草除了浮萍的生長(zhǎng)受到促進(jìn)外，其他11中雜草均受到不同程度的抑制，地上部干物重總抑制率為90.34％。
　　 總之，化感水稻P1312777在稗草脅迫下，其酚類和萜類代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)，加速了酚酸類和萜類化感物質(zhì)的代謝合成并釋放到環(huán)境。化感物質(zhì)有效地破壞了稗草的保護(hù)酶

16、體系，降低了伴生雜草光合作用效率，減少了植株中葉綠素和可溶性糖、可溶性蛋白的含量，抑制了稗草對(duì)N、P、K營(yíng)養(yǎng)元索的吸收利用，這些因素最終導(dǎo)致稗草生長(zhǎng)受到抑制。組合萜類在較低濃度下顯示出高的抑草活性，是具有開(kāi)發(fā)潛力的新一代天然除草劑候選者。本研究從受體稗草和供體水稻兩個(gè)方面，全面分析了不同稗草密度脅迫下水稻化感作用的變化與分子機(jī)制，獲得水稻化感抑草的“形態(tài)表現(xiàn)——生理響應(yīng)——基因表達(dá)——物質(zhì)含量——抑草能力”之間的相關(guān)性證據(jù)鏈，取得比較一