豫產(chǎn)道地中藥材金銀花離體培養(yǎng)技術研究.pdf

1、金銀花(Lonicerajaponica Thunb.)是忍冬科忍冬屬多年生木質藤本,其干燥花蕾和初開的花是臨床上常用的藥物,主要藥用成分是綠原酸和異綠原酸,具有抑菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、解熱、保肝、止血、降脂、抗生育、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種功效。主產(chǎn)于河南省封丘縣的金銀花是我國著名的道地中藥材,但在生產(chǎn)中,其品種單一、退化嚴重且繁殖速度較慢,無法滿足大田規(guī)模化種植和市場的需求。針對以上問題,我們首次對會銀花中的優(yōu)良品種“會豐一號”的離

2、體培養(yǎng)進行了系統(tǒng)的研究。取得了如下研究成果:
　　 1.建立了無菌培養(yǎng)技術體系。將會銀花頂芽剝離成兩葉一心后,在75％酒精中滅菌30 s,再用0.1％升汞處理15 min,然后無菌水沖洗5-6次,無菌苗得率達78.90％,接種于MS+6-BA1.0 mg·1-1+NAA0.2 mg·L-1培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),30 d即可獲得無菌試管苗。
　　 2.建立了快繁技術體系。適于試管苗快繁的培養(yǎng)基是MS+6-BA0.5mg·L-1

3、+NAA0.1 mg·L-1+生物素-D2 mg·L-1,繁殖周期為28 d,繁殖系數(shù)達到7.37;適于生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA3 mg·L-1+0.2 g·L-1活性炭+15 g·L-1蔗糖,配以合適的栽后管理,移栽成活率達100％。
　　 3.探討了愈傷組織誘導與繼代的最佳條件。最佳外植體是花蕾,其次是葉片,最佳培養(yǎng)基是MS+NAA2 mg·L-1+6-BA0.01 mg·L-1+2,4-D0.5 mg·L-1,誘導

4、率達100％:適宜的繼代培養(yǎng)基是MS+6-BA2 mg·L-1+KT0.75 mg·L-1+NAA0.25mg·L-1,在此繼代培養(yǎng)基上,經(jīng)過3-5次繼代后可以得到四種不同類型的愈傷組織。
　　 4.建立了細胞懸浮培養(yǎng)技術體系。選擇黃白色、小顆粒、結構疏松、生長迅速的愈傷組織轉入MS+6-BA1.5 mg·L-1+KT0.75 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1的液體培養(yǎng)基中,建立細胞懸浮培養(yǎng)體系。在該體系中細胞生長曲線呈

5、“S”型,可分為延遲期(0-12 d)、指數(shù)生長期(12-18 d)和緩慢生長期(18-24 d)三個階段,培養(yǎng)過程中細胞干重呈現(xiàn)上升趨勢,并在18 d時達到最大,為8 g·L-1。
　　 5.研究了細胞懸浮培養(yǎng)過程中生理生化變化規(guī)律。(1)可溶性糖含量在培養(yǎng)過程中先下降后上升,3-18 d時,可溶性糖含量迅速上升,并于18 d時達到峰值;(2)可溶性蛋白質含量呈降升降趨勢,0-6 d時緩慢下降,6-9 d時明顯增長,9-15

6、d時相對含量變化不大,于12 d時可溶性蛋白質含量達到峰值,比細胞生長高峰提前6 d,之后呈下降趨勢;(3)POD活性大致呈先升后降的趨勢,0-6 d時先升后降,3 d時是一小高峰,6-12 d時伴隨著細胞旺盛生長,開始迅速上升并在12 d時達到高峰,之后持續(xù)下降;(4)SOD活性呈先升后降的趨勢,0-9 d時緩慢增長,9-12 d時迅速升高,12 d時達至峰值,之后呈持續(xù)下降趨勢;(5)懸浮培養(yǎng)液的pH值先下降、后略微上升、再漸趨于平

7、緩,維持在5.14-4.89之間;(6)懸浮培養(yǎng)液的電導率呈先緩慢上升后急劇下降再稍上升的趨勢,0-12 d時,培養(yǎng)液的電導率一直呈極緩慢上升趨勢,在12 d時升至最高點(0.53×104μs·cm-1),隨即呈下降趨勢,與細胞生長呈現(xiàn)一定的相關性;(7)培養(yǎng)周期中綠原酸含量呈升降升降的趨勢,0-6 d,綠原酸呈急劇上升趨勢,在第6 d時升至最高點,隨即呈下降趨勢,15-21 d時再次呈上升趨勢,直至在第21 d時達到另一峰值,只是比第