長江、黃河源頭地區(qū)土壤中暗色絲孢菌物種多樣性研究.pdf

1、土壤真菌是指以土壤作為活動場所完成全部或部分生活史的真菌，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮巨大作用，具有豐富的多樣性。長江、黃河源頭地區(qū)地處青藏高原腹地，自然環(huán)境極其嚴(yán)酷，主要表現(xiàn)在兩個方面：一是高海拔，低氣溫，干旱；二是低植被，生態(tài)效能低。其特殊的地理條件蘊育了極其脆弱而低轉(zhuǎn)化狀態(tài)的高寒干旱的生態(tài)系統(tǒng)，特殊的生態(tài)環(huán)境蘊育了該地區(qū)特殊的土壤真菌物種多樣性。 本研究是我國土壤暗色絲孢真菌多樣性研究的一部分，著重考察長江、黃河源頭地區(qū)土壤中的暗

2、色絲孢真菌及其生態(tài)分布特點，了解該地區(qū)土壤真菌種類，進一步豐富我國生物多樣性方面的知識，為相關(guān)研究和真菌資源開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。長期以來無性態(tài)真菌(Anamorphic Fungi)的分類主要以形態(tài)特征為根據(jù)，分類的依據(jù)主要包括：載孢體的類型(如載孢體菌絲狀、孢梗束狀、瘤座狀、分生孢子器狀等)、分生孢子的形態(tài)(包括單胞孢子、雙胞孢子、多隔孢、磚格孢、線形孢、卷旋孢、星狀孢)及分生孢子的形成方式與產(chǎn)孢梗(細(xì)胞)的延伸方式(如體生式、芽生式等

3、)。本論文以自己分離到的34屬暗色絲孢真菌為實材，在傳統(tǒng)形態(tài)分類的基礎(chǔ)上，進行ITS-rDNA序列分析，以豐富對無性態(tài)真菌分類信息的認(rèn)識，探索此類真菌屬、種級形態(tài)分類標(biāo)準(zhǔn)的分子依據(jù)。同時，對本實驗室積累菌株較多的矛束霉屬、毛束霉屬和粘束孢屬等三屬真菌的代表性種，進行若干基因片段的分子生物學(xué)測定，為屬的界定及屬下種的劃分，在形態(tài)分類的基礎(chǔ)上尋求新的分子生物學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。 筆者等先后于2006-2007兩年，從長江、黃河源頭地區(qū)采集混

4、合土壤樣品200份，涉及的生境類型包括：森林、草原、農(nóng)田、戈壁、沙漠、荒地、濕地、高山草甸等八類。采用稀釋平板法、土壤平板法等分離培養(yǎng)，共獲得700多個菌株。從中鑒定出暗色絲孢真菌35屬，92種。其中，新種17個，新組合1個，中國新紀(jì)錄種8個。所研究的屬、種均作詳細(xì)形態(tài)描述和分布地點、生境引證。對有關(guān)屬、種級分類地位的變遷、范疇、分類標(biāo)準(zhǔn)等分類問題，主要是相似屬、種之間的區(qū)別進行了簡要討論。 一、暗色絲孢真菌物種多樣性

5、新種：球孢矛束霉、到達漆斑霉土壤變種 、青海卷旋孢、大孢單格孢 、黃河單格孢、多變粉枝孢、矮小側(cè)多格孢、多變小鼻枝霉、中華齒梗孢、光滑齒梗孢、長孢齒梗孢、土生帚霉、青霉?fàn)钪忝?、刺突帚霉、長孢葡萄穗霉、小孢短梗蠕孢、戈壁維羅納霉、圓孢維羅納霉。 未定名種(七個)：枝頂孢屬Acremonium sp.、頭梗霉屬Cephaliophora sp.、枝孢屬Cladosporium sp.、帚霉屬Scopulariopsis sp.1，S

6、copulariopsis sp.2、輪枝孢屬Verticilliumsp.、沃德霉屬 Wardomyces sp.。 中國新紀(jì)錄種(八個)：花菱草頂孢Acroconidiella eschscholtziae(Harkn.) M.B.Ellis、棉絮狀葡萄孢Botrytis byssoidea Walker、膨梗粘鞭霉Gliomastix inflate(C.H.Dickinson)W.Gams，、樹狀齒梗孢 Scolecob

7、asidium dendroides Pirozynski& Hodges、冬眠帚霉Scopulariopsis hibernica A.Mangan、喜糞維羅納霉 Veronaea coprophila(Subram.&Lodha)M.B.Ellis、異形沃德霉Wardomyces anomalus Brooks& Hansf.、土生沃德霉Wardomyceshumicola Hennebert& G.L.Barron。 其余

8、為國內(nèi)已知種。所有研究過的分離物標(biāo)本(干制培養(yǎng)物)與活菌種均保存在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)標(biāo)本室(HSAUP)。 在分類研究的基礎(chǔ)上，以物種豐富度、種群優(yōu)勢度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、群落均勻度、生態(tài)位寬度及生態(tài)位重疊指數(shù)等為衡量指標(biāo)，對黃河源頭地區(qū)土壤中的暗色絲孢真菌物種多樣性及其與生態(tài)類型間的相互關(guān)系進行了初步分析。研究發(fā)現(xiàn)，暗色絲孢真菌在不同生態(tài)類型中的數(shù)量和分布特征差異明顯。不同生態(tài)類型中的優(yōu)勢物種(屬級)

9、不同，物種多樣性與植被密切相關(guān)。植被豐富的森林、草原生境中，暗色絲孢真菌物種多樣性明顯高于植被稀疏的戈壁、沙漠。相對于我國土壤暗色絲孢真菌多樣性考察研究中對低海拔地區(qū)的研究結(jié)果，長江、黃河源頭地區(qū)的土壤暗色絲孢真菌物種數(shù)量顯著較少，蠕形分生孢子真菌等大孢子無性態(tài)真菌種類較少，而小孢子物種相對較多。 二、分離方法的改進 暗色絲孢真菌人工培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基有PDA，PCA，CMA，TWA+W等；培養(yǎng)條件一般為25℃，12h光照

10、/12h黑暗，培養(yǎng)1～3周(培養(yǎng)時間根據(jù)不同的屬、種產(chǎn)孢及孢子成熟所需時間的長短而定)。筆者根據(jù)土壤樣品采集地點的高海拔、低氣溫特點，適當(dāng)降低了培養(yǎng)溫度，把培養(yǎng)溫度調(diào)整到18℃，并根據(jù)每個樣品土壤類型，在培養(yǎng)基中適當(dāng)加入了原產(chǎn)地土壤浸出液，從而大大提高了分離效果。此外，機械損傷、適當(dāng)?shù)牡蜏卮碳さ忍幚?，有利于促進暗色絲孢真菌的產(chǎn)孢。 三、基于5.8S rDNA-ITS序列的屬級分類檢索表分析 通過5.8S rDNA-ITS

11、序列分析，用Neighboring-joining方法對論文中涉及的32屬構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。除若干對相似屬，如：矛束霉屬與毛束霉屬、粘鞭霉屬與枝頂孢屬、側(cè)，多格孢屬與維羅納霉屬、頂孢屬與彎孢屬序列相似性為98％-100％外，其余各屬均能在較明確遺傳距離處完全分開。說明5.8S rDNA-ITS序列分析對土壤暗色絲孢真菌屬級分類很有價值。特別是5.8S rDNA-ITS序列能夠較好的反映出無性態(tài)真菌形態(tài)分類中，芽生式產(chǎn)孢這一屬級分類標(biāo)準(zhǔn)，而

12、對體生式產(chǎn)孢的特性，則未能明確地反映。全壁芽生式和內(nèi)壁芽生式在系統(tǒng)發(fā)育樹中明確劃分，產(chǎn)孢方式為全壁芽生式的沃德霉屬、矛束霉屬、毛束霉屬等聚為一支。同時系統(tǒng)發(fā)育樹也能夠很好的區(qū)分內(nèi)壁芽生瓶梗式和內(nèi)壁芽生孔生式的真菌。但也存在少數(shù)例外，產(chǎn)孢方式為全壁芽生和內(nèi)壁芽生的個別屬在聚類系統(tǒng)樹中序列相似性較高，需要進一步的實驗來求得合理的解釋。 四、對矛束霉屬Doratomyces、毛束霉屬Trichurus、粘束孢屬Graphium代表性種

13、，進行5.8S rDNA-ITS序列分析和mt-SSU基因序列分析，用Neighboring-joining方法構(gòu)建聚類系統(tǒng)樹的結(jié)果表明，粘鞭霉屬Graphium能與其他兩供試屬明確區(qū)分，而矛束霉屬Doratomyces和毛束霉屬Trichurus供試菌株之間的5.8S rDNA-ITS序列相似性及mt-SSU基因序列相似性均達到97％-100％，兩個片段序列在矛束霉屬Doratomyces和毛束霉屬Trichurus中具有高度保守性，

14、不僅不能在屬級水平上分開，在形態(tài)上差異顯著的種間也不能進行區(qū)分。這一結(jié)果支持將矛束霉屬和毛束霉屬合并的觀點。粘鞭霉屬各供試菌株之間，通過5.8S rDNA-ITS序列比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可以劃分為3個進化支，明確劃分出拜迪粘束孢Graphium dubautiae，其他種間的界線不明顯。在據(jù)mt-SSU基因序列構(gòu)建的聚類系統(tǒng)樹上，Graphium屬內(nèi)8個供試菌株被劃分為4個進化支，進化支之間序列相似性僅為63％-94％，而同分支內(nèi)各菌株

15、之間序列相似性均為100％。分析結(jié)果與5.8S rDNA-ITS序列分析結(jié)果稍有差異，這可能與5.8S rDNA-ITS序列同mt-SSU基因序列進化速率不一致相關(guān)。由于5.8S rDNA-ITS序列和mt-SSU基因序列在三屬內(nèi)的高度保守性，由其構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹未能將供試的屬、種進行有效區(qū)分，預(yù)示僅通過這兩個基因片段對矛束霉屬、毛束霉屬和粘束孢屬及以下分類單位進行區(qū)分是不充分的，需要借助多基因分析手段才能真正明確供試屬、種正確的分類地