基于微流控芯片的補(bǔ)體結(jié)合及其在血清學(xué)檢測中的應(yīng)用.pdf

1、從古至今，各種傳染性疾病的爆發(fā)和流行嚴(yán)重危害著人類的生命和健康。補(bǔ)體結(jié)合試驗作為一種經(jīng)典的血清學(xué)技術(shù)已廣泛用于多種傳染病病原體的檢測。與酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）相比，免去了蛋白的固定、封閉、洗滌及酶標(biāo)抗體的使用，大大簡化了實驗步驟。然而傳統(tǒng)的補(bǔ)體結(jié)合試驗在試管或孔板里進(jìn)行，存在試劑用量大，反應(yīng)時間慢和受實驗室操作地點限制等缺陷。另外，其結(jié)果的測定通常是用肉眼觀察反應(yīng)后溶液的澄清度和紅細(xì)胞沉積量，所以靈敏度不高。隨著科技的進(jìn)步，現(xiàn)代

2、檢驗醫(yī)學(xué)出現(xiàn)了現(xiàn)場即時檢驗的發(fā)展趨勢。微流控芯片是一種“微”而“全”的分析技術(shù)平臺，具有低成本、易操作、分析速度快、耗樣量小、體積小便于攜帶和自動實現(xiàn)檢測等諸多優(yōu)點，已成為實現(xiàn)即時檢驗的重要技術(shù)手段。為了推進(jìn)檢驗醫(yī)學(xué)的即時檢測，本文致力于構(gòu)建幾種簡單易操作的微流控芯片，以此為操作平臺改進(jìn)傳統(tǒng)的補(bǔ)體結(jié)合試驗或結(jié)合魯米諾化學(xué)發(fā)光實現(xiàn)對病原標(biāo)志物快速、靈敏、低成本的檢測。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴構(gòu)建雙通道和三通道的PDMS/玻璃復(fù)合

3、微流控芯片作為微型生物反應(yīng)平臺進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。首先根據(jù)液相和固相補(bǔ)體結(jié)合試驗的實驗特點，設(shè)計并加工制作兩通道和三通道結(jié)構(gòu)的PDMS/玻璃微流控芯片分別用于實施液相和固相補(bǔ)體結(jié)合試驗。其次，在96孔板里用傳統(tǒng)的方法對補(bǔ)體和溶血素濃度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化實驗選用的病原標(biāo)志物為癌胚抗原（CEA）。實驗選用1％的低熔點瓊脂糖包裹紅細(xì)胞作為固相指示系統(tǒng)，并對其和紅細(xì)胞混合體積比進(jìn)行了優(yōu)化。然后將具有特定結(jié)構(gòu)的PDMS/玻璃芯片固定于PM MA夾具中形

4、成微器件裝置，由于PDMS的柔軟可形變性使得微器件裝置在夾具的壓力作用下具有調(diào)控芯片中不同腔體間液體隔絕和交流的功能。用液相的紅綠色食品染料對微裝置特征進(jìn)行了驗證，并以此建立補(bǔ)體結(jié)合試驗的樣品系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。優(yōu)化實驗結(jié)果表明最適宜觀察溶血現(xiàn)象的條件為：溶血素與紅細(xì)胞的濃度比為1:125，補(bǔ)體濃度為每毫升40單位，1％低熔點瓊脂糖與紅細(xì)胞的最優(yōu)體積比為1:5。在以上優(yōu)化條件下，芯片上的液相和固相補(bǔ)體結(jié)合試驗成功實現(xiàn)了一系列未知濃度目標(biāo)物（

5、癌胚抗原CEA和重組甲型禽流感rH7N9）的快速檢測，并通過在人血清中特異性檢測rH7N9和CEA成功證明了芯片補(bǔ)體結(jié)合試驗在實際活檢中的可行性。本芯片補(bǔ)體結(jié)合試驗體系不僅繼承了補(bǔ)體結(jié)合試驗中操作簡便的優(yōu)點，還具有來自微流體平臺的快速測定和低樣品消耗的優(yōu)勢。它可作為微流控免疫分析法如ELISA的補(bǔ)充或備份工具用于疾病的即時診斷。⑵在構(gòu)建PDMS-玻璃微流控芯片進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗和魯米諾化學(xué)發(fā)光協(xié)同補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)實現(xiàn)超靈敏蛋白質(zhì)檢測的研究基礎(chǔ)

6、上，開發(fā)了低成本的紙基微流控芯片作為操作平臺實施補(bǔ)體結(jié)合試驗，并加入魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)放大溶血信號。與PDMS/玻璃芯片相比，紙芯片的制備更簡單、成本更低，能真正實現(xiàn)便攜式、一次性分析。紙基陣列芯片采用一次性光刻微通道于封口膜上并將其熔滲入紙里的方法制作。紙基-Parafilm?復(fù)合3D微流控芯片采用切割封口膜成型微通道結(jié)構(gòu)，隨后將其與聚對苯二甲酸乙二醇酯（P ET）塑料膜層壓的方法制作。整個制作過程只需10分鐘。紙基陣列芯片用于開展液

7、相補(bǔ)體結(jié)合試驗。首先對紙上低熔點瓊脂糖的有無、樣品系統(tǒng)和指示系統(tǒng)在紙芯片上的反應(yīng)時間、待檢紙芯片與魯米諾/H2 O2紙芯片的相對位置等條件進(jìn)行優(yōu)化。實驗結(jié)果表明：加有瓊脂的實驗組能得到更好的實驗結(jié)果；30分鐘是紙芯片上樣品系統(tǒng)和指示系統(tǒng)進(jìn)行溶血反應(yīng)的最佳時間；魯米諾/H2O2紙芯片覆蓋在樣品芯片的上面能得到更好的CL信號。在以上優(yōu)化條件下，紙芯片上的液相補(bǔ)體結(jié)合試驗結(jié)合魯米諾化學(xué)發(fā)光實現(xiàn)了對未知濃度rH7N9的快速檢測。紙基-Paraf