柔嫩艾美耳球蟲3-1E基因的原核表達和真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及免疫保護性研究.pdf

1、雞球蟲?。–occidiosis）是由艾美耳科（Eimeriidae）艾美耳屬（Eimeria）球蟲引起的一種嚴重危害雞生長發(fā)育的寄生原蟲病。該病呈世界性分布，難于防治。迄今公認的雞艾美耳球蟲病的病原有9種，其中柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）為致病力最強的球蟲之一。目前防治球蟲病的手段主要依賴于藥物，但藥物耐藥性的產(chǎn)生、研制新藥費用之高以及人們對藥物殘留的日益關(guān)注和環(huán)境保護意識的增強，使雞球蟲病的防治處在一個十分無奈和尷尬的境地，

2、人們迫切期望找到一種更好的防治手段來取代藥物治療。
　　 本研究選擇了在禽類艾美耳球蟲各蟲種間保守性較高的柔嫩艾美耳球蟲3-1E基因，應(yīng)用DNA重組技術(shù)將該基因分別克隆入原核表達載體pET-32a（+）和真核表達載體pcDNA3.1（+）中，而且在真核表達質(zhì)粒中3-1E基因下游插入在抗球蟲免疫中發(fā)揮重要作用具有較好佐劑效果的雞IFN-γ基因和雞IL-2基因。并用重組抗原和真核重組DNA質(zhì)粒分別免疫動物，觀察其誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性免疫

3、應(yīng)答反應(yīng)，探討其作用機制，并通過對雞只攻擊E.tenella的保護作用檢測其抗球蟲效果。研究結(jié)果顯示：
　　 1.構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET-32a（+）-3.1E，經(jīng)過酶切鑒定，在DNA Marker6000bp及500bp處有明顯條帶，與理論中pET-32a（+）載體5900bp及3-1E基因513bp相一致；PCR鑒定表明用3-1E基因特異性引物可以在DNA Marker500bp處擴增得到一明顯條帶，與理論中3-1E基因

4、513bp相一致；委托生物公司進行序列測定也顯示序列正確且未發(fā)生突變。由此表明pET-32a（+）-3-1E質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.將質(zhì)粒pET-32a（+）-3-1E轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細胞并進行了原核表達。對表達蛋白的可溶性、誘導(dǎo)表達時間及誘導(dǎo)劑IPTG的濃度進行優(yōu)化表明在IPTG濃度為0.8mmol/L誘導(dǎo)6h時表達量最大，所表達重組蛋白為可溶性蛋白。將重組蛋白進行western-blot試驗，可以與感染柔嫩艾美耳球

5、蟲的雞陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 3.對雞只肌肉接種重組3-1E蛋白進行免疫保護試驗，并同時設(shè)立重組蛋白+弗氏完全佐劑（FCA）對照組、百球清藥物對照組、不免疫攻蟲對照組（紅組）、不免疫不攻蟲對照組（白組）。結(jié)果顯示，重組3-1E蛋白能夠不同程度提高血清IgG、IL-4、IFN-γ的水平，但對脾臟T淋巴細胞增殖功能的作用較小，而所有指標(biāo)在加入弗氏完全佐劑（FCA）的對照組中有小幅度的提高。重組3-1E蛋白與加入弗氏完全佐劑的

6、重組3-1E蛋白的抗球蟲指數(shù)（ACI）分別為171.45、174.92，具有中等抗球蟲效果。
　　 4.構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒，將E.tenella3-1E基因與雞IFN-γ基因、雞IL-2基因分別串聯(lián)在真核表達載體pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-3-1E-IFN-γ、pcDNA3.1（+）-3-1E-IL-2，同時構(gòu)建對照質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-3.1E、pcDNA3.1f+）-IFN-γ、

7、pcDNA3.1（+）-IL-2。經(jīng)過酶切鑒定、PCR鑒定，其結(jié)果均與理論中pcDNA3.1（+）載體5428bp、3-1E基因513bp、雞IFN-γ基因495bp及雞IL-2基因429bp相一致；委托生物公司對序列進行測定后結(jié)果也與預(yù)期序列一致，未發(fā)生突變。證明上述各質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 5.將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-3-1E-IFN-γ及pcDNA3.1（+）-3-1E-IL-2免疫雞只，檢測其在雞體內(nèi)基因轉(zhuǎn)

8、錄及表達的情況。通過RT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄情況可得到預(yù)期大小的條帶，通過western-blot試驗檢測基因表達情況也可得到預(yù)期大小的特異性條帶。證明質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-3-1E-IFN-γ及pcDNA3.1（+）-3-1E-IL-2在雞體內(nèi)均可正常工作。
　　 6.將真核表達質(zhì)粒免疫雛雞進行免疫保護試驗，其結(jié)果表明，pcDNA3.1（+）-3-1E-IFN-γ、pcDNA3.1（+）-3-IE-IL-2均能明顯地提高

9、血清IgG、IL-4、IFN-γ的水平，在脾臟T淋巴細胞增殖功能方面有較大的增強作用，而以pcDNA3.1（+）-3-1E-IL-2效果最佳。從抗球蟲指數(shù)（ACI）來看，PcDNA3.1（+）-3-1E-IFN-γ、pcDNA3.1（+）-3-1E-IL-2分別為181.04、187.30，具有有效地抗球蟲效果。
　　 本試驗將柔嫩艾美耳球蟲重組3-1E基因作為保護性基因，構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒及真核表達質(zhì)粒，并在將原核表達蛋白及真