斑馬魚acta1啟動(dòng)子的分離及其表達(dá)載體在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因熒光魚中的應(yīng)用.pdf

1、我國是世界水產(chǎn)大國，將轉(zhuǎn)基因等現(xiàn)代生物技術(shù)引入傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，已成為必然的發(fā)展趨勢?，F(xiàn)代生物技術(shù)，在觀賞水族業(yè)中，更具應(yīng)用前景。隨著組織特異性啟動(dòng)子研究的深入，用熒光基因構(gòu)建重組子，并轉(zhuǎn)入魚受精卵中，獲得在不同部位發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因觀賞魚技術(shù)已經(jīng)得到初步應(yīng)用。本研究所用到的單聚體綠色熒光蛋白（AcGFP）是一種新穎的報(bào)告基因，來源于水母體內(nèi)藍(lán)色發(fā)光蛋白質(zhì)，是EGFP熒光蛋白質(zhì)的變異體。與單聚體GFP的氨基酸有94％的同源性。可在體外或正在

2、發(fā)育的胚胎或成體的原位方便地進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。 肌動(dòng)蛋白（actin）是微絲的結(jié)構(gòu)成分，分子量為43kD。斑馬魚的α-actin1基因位于其第17號染色體上，所調(diào)控的α-肌動(dòng)蛋白1為骨骼肌所特有。本研究利用PCR技術(shù)，從斑馬魚基因組DNA中分離了斑馬魚α-肌動(dòng)蛋白1（α-actin1）基因的啟動(dòng)子及其上游調(diào)控序列片段（2019bp）。序列分析表明，該啟動(dòng)子所在區(qū)域片段序列與NCBI網(wǎng)上公布的α-actin1基因5’側(cè)翼區(qū)相應(yīng)序列的相

3、似性為98.7％，經(jīng)進(jìn)一步分析，在67位發(fā)現(xiàn)了100％MEF2順式調(diào)控序列元件，在47位、1078位和1636位發(fā)現(xiàn)了88.9％MEF2順式序列調(diào)控元件。在370位、679位以及802位發(fā)現(xiàn)了三個(gè)E順式序列盒調(diào)控元件，MEF2盒，E盒等都對肌肉表達(dá)起調(diào)控作用。分析還發(fā)現(xiàn)，在所得序列的1667位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)錄中起重要作用的TATA盒。根據(jù)第一個(gè)外顯子起始的所在位點(diǎn)，分析軟件初步確定了所得片段的1714位點(diǎn)的A為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。 將

4、分離得到的α-actin1基因啟動(dòng)子及其上游調(diào)控序列片段與AcGFP熒光基因進(jìn)行重組，得到α-actin1-AcGFP重組子。通過基因?qū)雰x，將α-actin1-AcGFP重組子導(dǎo)入斑馬魚受精卵細(xì)胞核中，獲得細(xì)肌絲（肌動(dòng)蛋白）特異性表達(dá)的綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。為確定外源基因（acta1-AcGFP）的最佳注射濃度，本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了100ng/ul、200ng/ul、300ng/ul、400ng/ul、500ng/ul五組不同外源D

5、NA濃度并以TE溶液為陰性對照，導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，觀察熒光基因在斑馬魚仔魚中的表達(dá)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，初步確定外源基因（α-actin1-AcGFP）的最佳注射濃度為400ng/ul，熒光表達(dá)率平均為16.0％，在表達(dá)熒光的仔魚中，有50％的魚苗熒光強(qiáng)表達(dá)，此時(shí)熒光魚苗畸形率為41.7％。對所得熒光魚苗分別在出膜1天、出膜10天和出膜1個(gè)月進(jìn)行觀察。通過觀察，發(fā)現(xiàn)熒光蛋白主要在骨骼肌中表達(dá)，且表達(dá)量隨仔魚肌肉的發(fā)育呈增長趨勢。從仔魚開始

6、直到成魚，在藍(lán)光燈的照射下，綠色熒光均能通過肉眼直接觀察。證明了分離得到的α-actin1啟動(dòng)子所在區(qū)域片段具有有效的驅(qū)動(dòng)功能。 本實(shí)驗(yàn)用不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺膠在蛋白水平分別對1月齡和3月齡表達(dá)熒光強(qiáng)的斑馬魚進(jìn)行了熒光蛋白定量，通過估算，初步確定獲得的1月齡和3月齡的熒光斑馬魚其熒光蛋白含量分別為1.05mg和3.5mg，分別占總體重（去內(nèi)臟）的0.75％和0.83％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光基因蛋白在斑馬魚體內(nèi)的表達(dá)是呈增長趨勢的