夏枯草種質(zhì)資源與藥材質(zhì)量評價研究.pdf

1、夏枯草（Prunella vulgaris L.）為唇形科多年生草本植物，以干燥果穗入藥，2005年版《中國藥典》收載，具有降血壓、降血糖、抗艾滋病和抗腫瘤等藥理作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、飲料等諸多領(lǐng)域。夏枯草主產(chǎn)江蘇、安徽、浙江和河南等地，但各地夏枯草種質(zhì)資源來源復(fù)雜，嚴(yán)重影響藥效的穩(wěn)定性。藥材質(zhì)量是保證中藥有效的前提，種質(zhì)遺傳多樣性是影響藥材質(zhì)量的根本內(nèi)在機理。本研究搜集了我國夏枯草主產(chǎn)區(qū)的15個?。ㄊ校?1份種質(zhì)資源，在闡

2、明其種質(zhì)資源遺傳特性和綜合評價藥材質(zhì)量的基礎(chǔ)上，探討種內(nèi)變異與藥材質(zhì)量的關(guān)系，選擇穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)的類群，保證臨床用藥的安全有效，為夏枯草資源的保護(hù)及優(yōu)良種質(zhì)的鑒定提供理論依據(jù)，從源頭上促進(jìn)夏枯草資源的開發(fā)利用和現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)對41份夏枯草不同種質(zhì)資源的16個植物學(xué)性狀進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，夏枯草不同居群在植物性狀上存在豐富的遺傳變異。應(yīng)用主成分分析法初步確定莖高、葉形指數(shù)、花冠長度、花冠喉部寬、花

3、萼長、下唇寬、上唇寬、主枝果穗長為影響夏枯草表型差異的主要因素。根據(jù)16個形態(tài)性狀，夏枯草不同居群可聚為三類，分別為高大早熟型、中間型、矮小晚熟型。
　　(2)應(yīng)用掃描電鏡SEM(Scanning Electron Microscope)技術(shù)，對26份不同夏枯草居群進(jìn)行花粉形態(tài)觀察和比較研究。結(jié)果顯示，夏枯草花粉近球形至扁球形，赤道面觀長橢圓形或?qū)挋E圓形，極面觀近圓形。萌發(fā)溝均為6個，輻射對稱，溝膜上密布顆粒物?；ǚ郾砻婢呔W(wǎng)狀雕紋

4、，網(wǎng)眼為不規(guī)則多邊形至近圓形，大小不一。不同居群在花粉大小、花粉形狀、外壁紋飾等方面存在差異?；ǚ弁獗诩y飾差異主要表現(xiàn)在網(wǎng)脊寬度、網(wǎng)胞形狀、網(wǎng)胞直徑和網(wǎng)胞密度，其演化順序可能為網(wǎng)胞排列由密到疏，由均勻到不均勻，由規(guī)則到不規(guī)則，網(wǎng)脊由寬到窄。
　　(3)利用ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats）分子標(biāo)記技術(shù)對夏枯草遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在物種水平上，多態(tài)性位點百分率(PPL)高達(dá)89.19％

5、，Nei's多樣性指數(shù)(He)平均為0.29。居群水平上，PPL在11％～50％之間，最高為福建建甌，最低為云南昆明，平均為45.04％。Nei's基因分化系數(shù)(Gst)為0.5177，表明居群內(nèi)的遺傳變異較大，居群間存在一定的分化。當(dāng)相似系數(shù)為0.79時，可將供試的26個夏枯草居群分為三大類群。第一類群來自于江蘇地區(qū)夏枯草居群，第二類包括安徽、貴州、江西和浙江等地居群，第三類則多為西南地區(qū)居群。來自同一地區(qū)的夏枯草大部分聚為一類，與地

6、理分布和氣候類型存在一定的聯(lián)系，但不是完全按照其進(jìn)行劃分。
　　(4)應(yīng)用SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)標(biāo)記對26份夏枯草資源進(jìn)行遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，在物種水平上，多態(tài)性位點百分率(PPL)高達(dá)87.93％，Nei's多樣性指數(shù)(He)平均為0.21。居群水平上，PPL在22％～67％之間，最高為浙江湖州居群，最低為云南昆明居群，平均為32.27％。N

7、ei's基因分化系數(shù)(Gst)為0.4850，表明居群內(nèi)的遺傳變異較大，居群間存在一定的分化。采用類平均法對26份夏枯草資源進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果與ISSR標(biāo)記結(jié)果略有差異，但基本呈現(xiàn)一致性。
　　(5)對我國不同地區(qū)夏枯草核糖體ITS(Intergenic Spacer region)堿基序列差異進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，ITS區(qū)長度均為669bp，ITS1、5.8s和ITS2序列長度分別為260bp、155bp和254bp。整個

8、ITS區(qū)共有7個變異位點，ITS1區(qū)內(nèi)有4個變異位點，均為信息位點。ITS2區(qū)內(nèi)有3個變異位點，均為單核苷酸變異位點。5.8S區(qū)域內(nèi)非常保守，沒有變異位點。根據(jù)兩者序列以鄰接法建立分子系統(tǒng)發(fā)生樹，表明夏枯草種內(nèi)至少存在5個變異類型，江西進(jìn)賢栽培構(gòu)成一單系分支，與所有野生居群區(qū)別開。
　　(6)以熊果酸、齊墩果酸、黃酮、多糖等生物活性成分為評價指標(biāo)對夏枯草藥材質(zhì)量進(jìn)行評價。結(jié)果表明，熊果酸等評價指標(biāo)較為合理、客觀，能充分地反映和控制

9、夏枯草總體質(zhì)量水平。不同居群夏枯草主要化學(xué)組分相似，但含量存在顯著差異。熊果酸含量在0.13％～0.40％之間;黃酮含量在2.16％～10.29％之間;多糖含量在5.29％～9.00％之間;所有化學(xué)成分均以四川瀘定含量最高，說明夏枯草種質(zhì)篩選潛力巨大。通過聚類分析可將36份夏枯草種質(zhì)分為五類，應(yīng)加強第二和第五類群的選育工作，為夏枯草藥材的質(zhì)量評價及發(fā)展道地藥材生產(chǎn)提供了依據(jù)。
　　(7)運用等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)測定

10、了夏枯草中13種無機元素含量。結(jié)果表明，不同居群夏枯草中均含豐富的宏量元素和微量元素，其分布特征較為一致，Ca、K含量最高，其次是Mg、P，最后依次是Fe、Al、Sr、Mn、Zn、Ti、Cu、Pb、Co。但不同居群中各種元素的含量差異顯著，這可能與不同種質(zhì)遺傳因素和土壤環(huán)境中各種元素的豐度密切相關(guān)。Pb、Fe、Cu、Ti、Al、Co之間存在較大的正相關(guān)性，說明夏枯草對其吸收可能存在一定的協(xié)同作用。應(yīng)用主成分分析初步確定夏枯草的特征元素為

11、Co、Fe、Cu、Ti、Al、P、Mg。
　　(8)以活性成分、商品性狀、檢查項目等為指標(biāo)，分別采用層次分析和綜合主成分分析法，綜合考察夏枯草不同居群藥材質(zhì)量，為夏枯草藥材質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示:層次分析和綜合主成分評價均能較全面的反映樣本信息，可用于中藥多指標(biāo)的質(zhì)量評價。兩種評價方法均顯示，四川瀘定、四川綿陽活性成分含量遠(yuǎn)高于其他居群，但果穗短小，適合于精品生產(chǎn)。江蘇南京玄武、江蘇鎮(zhèn)江、江蘇儀征、江蘇盱眙、安徽合肥、安徽

12、滁州等地夏枯草活性成分含量較高，果穗較長，產(chǎn)量較高，綜合性狀良好，適合于種植推廣。
　　(9)對夏枯草不同部位活性成分含量進(jìn)行比較分析，為合理開發(fā)利用夏枯草資源提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示，夏枯草不同部位活性成分含量存在明顯的差異。熊果酸在不同部位中含量為:果穗＞全草＞葉片＞莖＞根;黃酮含量順序為:葉片＞全草＞果穗＞莖＞根;多糖含量順序為:葉片＞根＞莖＞全草＞果穗;無機元素Pb、Cu、Fe、Co、Al、Mn、Ti在根中含量最為豐富，