玉米粗縮病抗病位點(diǎn)的分子標(biāo)記定位.pdf

1、目前國內(nèi)外對玉米粗縮病抗病基因的研究沒有突破性進(jìn)展，其制約因素主要有玉米植株的抗病性鑒定難度大和缺乏適用于抗性基因定位的群體。 一、玉米粗縮病人工接種和分子檢測技術(shù)的建立本工作利用灰飛虱為傳毒媒介，以山東濟(jì)南地區(qū)自然發(fā)病的典型的玉米粗縮病植株作為毒源飼喂灰飛虱。將經(jīng)過飼毒培養(yǎng)的灰飛虱隨機(jī)分成3組，每組由若干樣本組成。第一組中每樣本含有灰飛虱1頭，第二組和第三組中每樣本分別含灰飛虱5頭或10頭。樣本勻漿液利用間接酶聯(lián)免疫方法檢測R

2、BSDV含量，進(jìn)而確定灰飛虱的帶毒率。對第一組12個樣本檢測，有3個樣本為陽性，得出灰飛虱帶毒率為25﹪。檢測每樣本含有5頭灰飛虱的第二組樣本，得出灰飛虱帶毒率為13.3﹪。由10頭灰飛虱組成的樣本均表現(xiàn)出陽性結(jié)果。因此，人工接種時每株小苗應(yīng)接種10頭灰飛虱，確保在接種的灰飛虱中至少有一頭攜帶有RBSDV。在此基礎(chǔ)上，以感病自交系掖478為材料，分別研究了植株發(fā)育時期(葉齡)，接種的蟲口密度和接種時間這三個因素對人工接種效果的影響。結(jié)果

3、表明：玉米植株早期易感病，人工接種后發(fā)病率高；當(dāng)蟲口密度為15頭和10頭灰飛虱接種二葉期的掖478幼苗時，發(fā)病率可分別達(dá)到100﹪和96﹪；以每株10頭灰飛虱的蟲口密度接種掖478幼苗時，接種期長，發(fā)病率高。根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和在不同接種條件下玉米植株的存活率，得出適宜的接種條件為：二葉期玉米植株、每株15頭經(jīng)過飼毒的灰飛虱和接種期5天。 玉米粗縮病人工接種鑒定體系的建立可使植株抗病性鑒定工作擺脫了田間環(huán)境因素波動的制約，得到穩(wěn)

4、定可靠的鑒定結(jié)果。將人工接種鑒定和熒光定量RT-PCR檢測方法結(jié)合起來，可以在一個分離群體中準(zhǔn)確鑒定發(fā)病植株和抗病植株，有助于玉米粗縮病抗病基因定位。 二、掖478×90110的分子標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建以高感玉米粗縮病的我國的玉米骨干自交系掖478為母本，以高抗玉米粗縮病的自交系90110為父本構(gòu)建作圖群體，取掖478×90110的150個F<,2>單株構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜。在篩選的86個RFLP標(biāo)記和456對SSR引物中，雙親間表

5、現(xiàn)多態(tài)性的標(biāo)記共有347個，多態(tài)頻率為66.0﹪；無擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR引物有16對；多態(tài)性穩(wěn)定的RFLP標(biāo)記59個。挑選出26個RFLP標(biāo)記和252對SSR引物進(jìn)行F<,2>群體的單株分析。對于共顯性標(biāo)記，與90110帶型相同的F<,2>單株賦值為A，與掖478帶型相同的F<,2>單株賦值為B，具雜合帶型(同F(xiàn)<,1>帶型)的賦值為H；對于顯性標(biāo)記，與90110帶型不同的F<,2>單株賦值為C，與478帶型不同的F<,2>單株賦值為D；缺

6、失記為"-"。將每一標(biāo)記在F<,2>群體中的分離數(shù)值與其相應(yīng)的孟德爾理論分離比例(顯性3:1、共顯性1:2:1)相比較，進(jìn)行x<'2>適合度檢驗(yàn)，驗(yàn)證每一標(biāo)記的分離是否符合孟德爾比例(即：是否表現(xiàn)為偏分離)。匯總RFLP和SSR標(biāo)記在F2群體中的分離數(shù)據(jù)，用MAPMAKER/EXP3.0軟件構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜。在278個標(biāo)記中，有271個標(biāo)記被分別劃分成10個連鎖群中。大部分標(biāo)記在本圖譜上的位置及排序與它們在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(Maiz

7、eGDB)的IBMNeighbors map 2004圖譜上的相同。本圖譜覆蓋玉米基因組(總長)2164.3 cM，標(biāo)記間平均距離為7.98cM，形成了自交系掖478x90110的分子標(biāo)記連鎖框架圖，可用于主效基因定位以及QTL的初步分析。本圖譜為玉米粗縮病抗病基因的分子標(biāo)記定位奠定了良好基礎(chǔ)，對發(fā)掘雙親之間其它優(yōu)異農(nóng)藝性狀基因資源具有重要價值，對于掖478的大量衍生自交系的遺傳改良也具有重要的意義。 三、利用分離群體定位玉米粗

8、縮病抗病位點(diǎn)通過人工接種鑒定和田間自然發(fā)病鑒定兩種方法，對自交系90110、掖478及其F<,2>群體、BC<,1>群體和部分重組自交系群體進(jìn)行了玉米粗縮病抗病性鑒定。兩種鑒定方法得到了一致的可以相互驗(yàn)證的結(jié)果。在F<,2>群體中，萊州地區(qū)鑒定材料的自然發(fā)病率為14.6﹪和13.3﹪：濟(jì)南地區(qū)鑒定材料的自然發(fā)病率為14.0﹪和12.7﹪；人工接種鑒定材料的三次重復(fù)的發(fā)病率分別為14.0﹪、14.0﹪和18.0﹪。在BC<,1>群體中，萊

9、州地區(qū)鑒定材料的自然發(fā)病率為36.0﹪和35.3﹪；濟(jì)南地區(qū)鑒定材料的自然發(fā)病率為33.3﹪和31.3﹪；人工接種鑒定材料的三次重復(fù)的發(fā)病率分別為36.0﹪、40.0﹪和35.0﹪。對F<,2>和BC<,1>群體中抗、感植株的比例分別進(jìn)行了卡方檢驗(yàn)，得出在掖478x90110這一組合中，粗縮病抗性不符合由一個或兩個基因控制的簡單的遺傳模式。37個重組自交系的人工接種鑒定結(jié)果與三年的田間自然鑒定結(jié)果相一致，不僅確定了這些自交系的粗縮病抗性

10、，而且進(jìn)一步驗(yàn)證了人工接種鑒定的可重復(fù)性。 取15株抗病的F<,2>植株的DNA等量混合組成F<,2>抗池，10株嚴(yán)重感病的F<,2>植株的DNA等量混合組成F<,2>感池；15株抗病的BC<,1>植株的DNA等量混合組成BC<,1>抗池，15株嚴(yán)重感病的BC<,1>植株的DNA等量混合組成BC<,1>感池。先用構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的SSR標(biāo)記檢測F<,2>抗池和F<,2>感池，再用在F<,2>抗池和F<,2>感池之間表現(xiàn)出多態(tài)

11、的SSR標(biāo)記檢測BC<,1>的抗池和感池。對于那些在BC<,1>的抗池和感池之間表現(xiàn)出多態(tài)且與在F<,2>的抗池和感池之間的多態(tài)相一致的標(biāo)記，初步認(rèn)為它們可能與玉米粗縮病抗病基因連鎖。通過SSR．BSA分析，我們找到了4個與玉米粗縮病抗病基因連鎖的分子標(biāo)記，分別為6號染色體上的ume1656(bin6.02)，7號染色體上的umcl401(bin7.02)，8號染色體上的bnlg1823(bin8.07)和umcl268(bin8.07

12、)。由于這4個標(biāo)記分別位于6、7、8染色體上，且抗病植株的SSR帶型在這些位點(diǎn)上與自交系90110的相同，推測在90110中至少存在3個玉米粗縮病抗病位點(diǎn)，分別以Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3表示。根據(jù)F<,2>分子標(biāo)記連鎖圖譜，我們選取了6號染色體上的umc1656、umc1006、umc1083、bn1g2191和umc1595共5個SSR標(biāo)記，7號染色體上的umc1401、umc1695、umcl666和umc2142共4個S

13、SR標(biāo)記，8號染色體上的bnlg1823、umc1268、umc1728、umc2014和umc1032共5個SSR標(biāo)記，檢測了150個經(jīng)過抗病性鑒定的F2單株。通過比較抗病位點(diǎn)與其附近每一SSR標(biāo)記之間的共分離比率，確定了在所選擇的SSR標(biāo)記中，umc1656、umc1401和bnlg1823分別是與Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3距離最近的標(biāo)記。利用共分離分析，Mrdd1位點(diǎn)被定位到標(biāo)記umcl656和bnlg2191之間，在F2

14、分子標(biāo)記連鎖圖譜中umc1656和bnlg2191之間的遺傳距離為4.5cM：Mrdd2位點(diǎn)被定位到標(biāo)記umc1401和umc1666之間，在F2分子標(biāo)記連鎖圖譜中umc1401和umcl666之間的遺傳距離為11.1cM；Mrdd3位點(diǎn)被定位到標(biāo)記bnlg1823和umc1268之間，在F<,2>分子標(biāo)記連鎖圖譜中bnlg1823和umc1268之間的遺傳距離為5.8cM。 四、利用重組自交系群體驗(yàn)證玉米粗縮病抗病位點(diǎn)的定位結(jié)

15、果根據(jù)F<,2>群體中玉米粗縮病抗病位點(diǎn)定位結(jié)果，選取與每一抗病位點(diǎn)最近的分子標(biāo)記及這個標(biāo)記兩側(cè)的標(biāo)記檢測了重組自交系群體中的18個抗病株系和19個感病株系。利用檢測這些重組自交株系的數(shù)據(jù)對每個抗病位點(diǎn)進(jìn)行共分離分析。在重組自交系群體里，Mrddl位點(diǎn)被定位在umc1656和bnlg2191之間；Mrdd2位點(diǎn)被定位在umc1401和umc1666之間；Mrdd3位點(diǎn)被定位在bnlg1823和umc1268之間，結(jié)果與利用F2群體中數(shù)據(jù)

16、的定位結(jié)果完全一致，確證了Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3位點(diǎn)為玉米粗縮病抗病位點(diǎn)，并且來自于抗病親本90110。另外，重組自交系群體檢測結(jié)果表明，一個抗病株系至少要有兩個來自于90110的抗病位點(diǎn)才能表現(xiàn)出抗病表型。 本工作對玉米粗縮病抗病基因進(jìn)行了初步定位，確定了3個抗病位點(diǎn)在染色體上的位置，這在基因組水平上證明了玉米粗縮病抗性是至少由3個基因控制的性狀，為玉米粗縮病抗病基因的精細(xì)定位奠定了基礎(chǔ)。鑒定出的與抗病位點(diǎn)連鎖的分