白腐真菌處理有機(jī)固體廢物過(guò)程中脂肪合成現(xiàn)象的研究i—平菇脂肪合成現(xiàn)象的初步研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：白腐真菌處理有機(jī)固體廢物過(guò)程中脂肪合成現(xiàn)象的研究I—平菇脂肪合成現(xiàn)象的初步研究</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 環(huán)境工程 </p><p>　　學(xué)生姓名

2、 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)利用kirk培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)平菇菌絲體，從兩方面研

3、究平菇菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中脂肪合成規(guī)律。首先驗(yàn)證平菇菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生脂肪，其次研究營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)平菇產(chǎn)脂的影響。利用蘇丹黑B染色法對(duì)菌絲體進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)顯微鏡下存在藍(lán)灰色的脂肪粒。分別采用干重法和酸熱法測(cè)定菌絲體的生物量和脂肪含量，并發(fā)現(xiàn)它們均先增加后減少，且在培養(yǎng)第10天，脂肪含量達(dá)到最高值4.16％。此外，利用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響脂肪含量的5個(gè)因素（葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2）進(jìn)行篩選。經(jīng)過(guò)

4、篩選，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4這3個(gè)因素對(duì)脂肪含量的影響最大。然后進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近關(guān)鍵因素的最大響應(yīng)區(qū)域。最后采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)培養(yǎng)基。結(jié)果表明，葡萄糖9.2 g/L、酒石酸銨0.82 g/L、KH2PO40.86 g/L，理論脂肪含量達(dá)到最高值11.36％。</p><p>　　關(guān)鍵詞：平菇；脂肪含量；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

5、；Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；營(yíng)養(yǎng)因子</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In this study, using the kirk medium staticly culture mycelium of Pleurotus ostreatus and studying the the law of producing li

6、pid in two ways. First, verifing mycelium of Pleurotus ostreatus can produce lipid. Next, studying the impact of nutritional factors on the lipid content of Pleurotus ostreatus. The mycelium were stained with Sudan black

7、 B and observed the obvious blue-gray lipid granules under the microscope. Respectively, adopting the dry weight method and acid-heat method for the deter</p><p>　　Key Words：Pleurotus ostreatus; lipid conten

8、t; Plackett-Burman design; steepest ascent design; Box-Behnken experimental design; nutritional factors</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><

9、;b>　　2 實(shí)驗(yàn)材料2</b></p><p>　　2.1 菌種來(lái)源2</p><p><b>　　2.2 培養(yǎng)基2</b></p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)試劑2</p><p>　　2.4 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備2</p><p>　　3 實(shí)驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)3</p&g

10、t;<p>　　3.1 實(shí)驗(yàn)方法3</p><p>　　3.1.1 菌種復(fù)活與續(xù)代培養(yǎng)3</p><p>　　3.1.2 平菇培養(yǎng)方法3</p><p>　　3.1.3 蘇丹黑B染色法3</p><p>　　3.1.4 生物量測(cè)定方法4</p><p>　　3.1.5 脂肪含量測(cè)定方法4<

11、;/p><p>　　3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4</p><p>　　3.2.1 平菇產(chǎn)脂的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)4</p><p>　　3.2.2 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4</p><p>　　3.2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)（Steepest ascent design）5</p><p>　　3.2.4 Box-Benhn

12、ken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)6</p><p><b>　　4 結(jié)果與分析7</b></p><p>　　4.1 驗(yàn)證平菇產(chǎn)脂的實(shí)驗(yàn)分析7</p><p>　　4.1.1 平菇生物量的變化分析7</p><p>　　4.1.2 平菇產(chǎn)脂情況分析8</p><p>　　4.1.3 平菇菌絲體蘇丹黑B染色

13、結(jié)果分析10</p><p>　　4.2 營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)平菇產(chǎn)脂影響的分析10</p><p>　　4.2.1 Plackett-Burman法篩選影響培養(yǎng)基的主要因素10</p><p>　　4.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)(Steepest ascent design)確定因素水平12</p><p>　　4.2.3 Box-Benhnken

14、實(shí)驗(yàn)確定主要因素的最優(yōu)水平12</p><p><b>　　5 討論16</b></p><p><b>　　6 結(jié)論17</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)18</b></p><p><b>　　致 謝20</b></p&g

15、t;<p>　　附錄3 脂肪的國(guó)標(biāo)測(cè)定方法41</p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　白腐真菌是一類絲狀真菌因腐生在樹(shù)木或木材上，引起木質(zhì)白色腐爛而得此名。它依靠降解木質(zhì)纖維材料的能力穿入木質(zhì)，侵入木質(zhì)細(xì)胞腔內(nèi)，釋放降解木質(zhì)素和其他木質(zhì)組分的酶，導(dǎo)致木質(zhì)腐爛成為淡色的海綿狀團(tuán)塊—白腐[1]。人類對(duì)于白腐真菌的研究已有近半個(gè)世

16、紀(jì)的歷史，因其特殊的生理生化機(jī)制及強(qiáng)大的降解代謝能力，已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。白腐真菌不僅能降解各種結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)物，甚至連雜酚油、氯代芳烴化合物這樣的混合污染物也能完全礦化[2]，所以它特有的降解機(jī)制在工業(yè)廢水中有廣闊的前景。目前，因?yàn)榘赘婢木z體對(duì)金屬離子和異生物質(zhì)有強(qiáng)有力的吸附作用[3,4]，使其成為新的生物吸附劑而被研究、制備和開(kāi)發(fā)。此外，利用白腐真菌混合發(fā)酵秸稈飼料，不僅產(chǎn)生一定量的粗蛋白，而且還能產(chǎn)生大量的小分子營(yíng)

17、養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、有機(jī)酸等。由于這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的存在一方面提高了動(dòng)物的消化吸收率，提高了飼料的營(yíng)養(yǎng)水平，另一方面也明顯地改善了飼料的理化性狀[5-9]。</p><p>　　在白腐真菌處理木粉雞糞混合物的時(shí)候，研究人員發(fā)現(xiàn)白腐真菌及其培養(yǎng)基混合的基材中脂肪含量有一個(gè)奇特的現(xiàn)象，即脂肪量隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律[10]。因此深入研究白腐真菌的脂肪合成規(guī)律，不僅可以填補(bǔ)脂肪代謝研究的空白，還可以有效控制白

18、腐真菌處理有機(jī)固廢后產(chǎn)生的菌糠中脂肪的含量。</p><p>　　由于目前基本沒(méi)有白腐真菌脂肪代謝研究的相關(guān)報(bào)道，所以本課題參考研究產(chǎn)油微生物的技術(shù)方法，選取白腐真菌中的平菇（Pleurotus ostreatus）作為研究對(duì)象，研究平菇在其生長(zhǎng)過(guò)程中是否有脂肪的合成和脂肪合成的規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)采用蘇丹黑B染色法定性驗(yàn)證平菇菌絲體內(nèi)存在脂肪，再用酸熱法定量測(cè)定平菇的脂肪含量。首先，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Plackett-Burm

19、an 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響平菇產(chǎn)脂的培養(yǎng)基組分進(jìn)行篩選。接著進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近關(guān)鍵因素的最大響應(yīng)區(qū)域。最后，采用Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)培養(yǎng)基。通過(guò)研究平菇菌絲體脂肪合成的規(guī)律，可以為白腐真菌處理固體廢物時(shí)脂肪代謝的控制打下一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為其脂肪酶組成的研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)材料</b></p>&l

20、t;p><b>　　2.1 菌種來(lái)源</b></p><p>　　本研究選用的白腐真菌菌種為平菇（Pleurotus ostreatus），由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供。</p><p><b>　　2.2 培養(yǎng)基 </b></p><p>　　PDA培養(yǎng)基：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加純水100

21、0ml，放在電爐上加熱，煮沸30min，然后用紗布過(guò)濾，濾液置500mL的錐形瓶中，接著在高壓滅菌鍋內(nèi)（121℃，1.2大氣壓）滅菌40min，滅菌后冷卻，放入冷藏柜保存土豆濾液。移取400mL土豆液，加入4g葡萄糖和10g瓊脂，待充分溶解后在高壓滅菌鍋內(nèi)（121℃，1.2大氣壓）滅菌40min，取出后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿大約為15～20 mL，冷卻凝固。</p><p>　　Kirk培養(yǎng)基：20g/

22、L葡萄糖（112mmol/L）、0.5g/L酒石酸銨（2.7mmol/L）、2.0g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.132g/L CaCl2 、1mg/L VB1及1ml/L微量元素（成分：CuSO4·5H2O 0.08g/L、H2MoO4 0.05g/L、MnSO40.07 g/L、ZnSO4 0.043g/L、 Fe2(SO4)3 0.05 g/L），100mL醋酸緩沖劑（pH4.5）

23、、用土豆濾液配制成1000ml[11,12]。</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p>　　用于菌絲體脂質(zhì)染色的試劑包括蘇丹黑B；藏紅T（番紅O）；二甲苯；無(wú)水乙醇。用于菌絲體脂質(zhì)提取的試劑包括鹽酸；石油醚（30℃～60℃沸程）；乙醚。用于配制Kirk培養(yǎng)基基質(zhì)的試劑包括葡萄糖；酒石酸銨；KH2PO4；CaCl2；MgSO4·7

24、H2O；VB1；CuSO4·5H2O；H2MoO4；MnSO4；ZnSO4；Fe2(SO4)3；醋酸鈉；冰醋酸。以上化學(xué)試劑均為分析純。</p><p>　　2.4 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器包括N-117M型顯微鏡；SW-CJ-5超凈工作臺(tái)；YXQ-75S11立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器；HWS型恒溫恒濕箱；FA2004型電子天平；HWS-28數(shù)顯恒溫

25、水浴鍋；WMK-02恒溫電熱干燥箱；通風(fēng)櫥；培養(yǎng)瓶。</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　　3.1 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.1.1 菌種復(fù)活與續(xù)代培養(yǎng)</p><p>　　配制PDA培養(yǎng)基，制成平板，在高壓滅菌鍋（121℃，1.2個(gè)大氣

26、壓）中滅菌30min，放置在無(wú)菌條件下冷卻后，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基中取一小塊母種，接種到PDA培養(yǎng)基上，置于溫度為25℃、濕度為65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至菌絲體長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。再按上述的方法，用打孔器從復(fù)活培養(yǎng)后的母種中取一塊圓形菌絲塊，植入新的PDA培養(yǎng)基中，在溫度為25℃、濕度為65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至菌絲體長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。</p><p>　　3.1.2 平菇培養(yǎng)方法</p>

27、<p>　　采用靜置培養(yǎng)方式，將配制的Kirk培養(yǎng)基分別裝入培養(yǎng)瓶中，每瓶培養(yǎng)瓶中裝50ml培養(yǎng)基，在高壓滅菌鍋（121℃，1.2大氣壓）中滅菌40 min。滅菌后，把培養(yǎng)瓶從高壓滅菌鍋中取出放入超凈臺(tái)內(nèi)，待冷卻至室溫。采用打孔器（直徑1.0cm）在PDA培養(yǎng)基上打孔取菌塊，然后將菌塊接入培養(yǎng)瓶里，使菌塊漂浮在Kirk培養(yǎng)基表面上。接種后將培養(yǎng)瓶放入溫度為25℃，濕度為65%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天。每個(gè)培養(yǎng)基設(shè)置6個(gè)平行樣

28、。</p><p>　　3.1.3 蘇丹黑B染色法</p><p>　　用酒精棉將載玻片擦拭一遍，再滴一滴蒸餾水于載玻片上，挑取少許菌絲體于其中，涂抹均勻，然后進(jìn)行熱固定。待冷卻后，加一滴0.3％蘇丹黑B染色液染色菌絲體，自然干燥10～15min。再滴加二甲苯對(duì)菌絲體脫色直至洗出液透明。干燥后番紅復(fù)染1～2min，水洗至洗出液透明。干燥后鏡檢，在光學(xué)顯微鏡（1600×）下觀察[1

29、3-15]。</p><p>　　3.1.4 生物量測(cè)定方法</p><p>　　先把定量濾紙放到80℃的烘箱中烘至恒重量，然后放到干燥器中冷卻到室溫稱得質(zhì)量m1。用布氏漏斗過(guò)濾分離菌球與培養(yǎng)基，用蒸餾水沖洗菌球表面，然后把濾紙及濾紙上的菌球放到80℃的烘箱內(nèi)烘至恒重。最后放到干燥器中冷卻到室溫稱得質(zhì)量m2。</p><p>　　菌球干重m=m2-m1[16]。&l

30、t;/p><p>　　3.1.5 脂肪含量測(cè)定方法</p><p>　　脂肪含量測(cè)定方法采用GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測(cè)定》中的酸水解法（又稱酸熱法），具體實(shí)驗(yàn)操作步驟見(jiàn)附錄3[17,18]。</p><p><b>　　3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)</b></p><p>　　3.2.1 平菇產(chǎn)脂的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)<

31、/p><p>　　在25℃，濕度為65％的恒溫恒濕箱中，用Kirk培養(yǎng)基培養(yǎng)平菇20天。從中抽取2、4、6、8、10、12、14、16、18、20這10個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)平行樣，其中1個(gè)為染色所用，其余為測(cè)定樣。先測(cè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)組菌絲體的生物量，再用蘇丹黑B染色法染色平菇菌絲體，顯微鏡下觀察菌絲體內(nèi)脂肪的情況。最后采用酸熱法測(cè)定平菇的產(chǎn)脂情況，包括測(cè)定菌絲體以及它的培養(yǎng)基脂肪含量。</p>

32、;<p>　　3.2.2 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)</p><p>　　PB法是一種近飽和的2水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。它基于非完全平衡塊原理，能用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，以從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研究。每個(gè)因素的兩水平分別取低水平與高水平[19]。</p><p>　　根據(jù)白腐真菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，結(jié)合營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)產(chǎn)油微生物產(chǎn)

33、脂影響的報(bào)道[20-23]，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法對(duì)影響平菇產(chǎn)脂的培養(yǎng)基組分進(jìn)行篩選，將葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2定為設(shè)計(jì)因素，其他</p><p>　　因素如微量元素、VB1、緩沖溶液、溫度等均恒定。這5個(gè)因素水平見(jiàn)表1。然后，通過(guò)Minitab 軟件對(duì)上述的5個(gè)因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)，具體情況見(jiàn)表2。</p>&l

34、t;p>　　表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平</p><p>　　表2 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果</p><p>　　3.2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)（Steepest ascent design）</p><p>　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果確定顯著影響因素，以擬合的回歸方程模型的系數(shù)符號(hào)和大小來(lái)設(shè)定顯著影響因素的步長(zhǎng)及變化方向，使

35、響應(yīng)值快速逼近最大響應(yīng)區(qū)間[24]。依據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4是影響平菇產(chǎn)脂的主要因素，再進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。然后根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化方向和步長(zhǎng)，最后快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳區(qū)域。表3為最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果。</p><p>　　表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果</p><p>　　3.2.4 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)</p&

36、gt;<p>　　BBD法是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，以對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法[25]。根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)的因素與水平，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用Design Expert軟件，得到17個(gè)培養(yǎng)基配方，每個(gè)配方2個(gè)平行樣。其具體的3個(gè)因素水平見(jiàn)表4、Box-Benhnke

37、n實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。</p><p>　　表4 響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平</p><p>　　表5 響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果</p><p><b>　　4 結(jié)果與分析</b></p><p>　　4.1 驗(yàn)證平菇產(chǎn)脂的實(shí)驗(yàn)分析</p><p>　　4.1.

38、1 平菇生物量的變化分析</p><p>　　圖1 平菇的菌絲體生長(zhǎng)情況</p><p>　　用Kirk培養(yǎng)基，在溫度25℃，濕度為65%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)平菇20天，從中抽取2、4、6、8、10、12、14、16、18、20這10個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行生物量以及脂肪含量的檢測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，平菇菌絲體隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加先增加后減少（如圖1）。所測(cè)得生物量也隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加

39、后減少的趨勢(shì)（如圖2）。初始，將平菇菌塊植入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，菌塊處于培養(yǎng)瓶中間，培養(yǎng)基清澈，顏色為深黃色。第二天，菌塊邊緣有一圈薄薄的蓬松的菌絲體長(zhǎng)出。第4天菌絲體逐漸變大，第6天菌絲體繼續(xù)增大，菌絲體呈現(xiàn)白色且比較蓬松。到第8天，菌絲體快長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)瓶且變得比較緊密。培養(yǎng)至第10天，培養(yǎng)基表面已長(zhǎng)滿菌絲體，此時(shí)的培養(yǎng)基顏色變淺，并且由于菌絲體產(chǎn)生許多代謝物使得培養(yǎng)基變得比較渾濁。至第16天菌絲體的生物量達(dá)到最大值0.3315g。當(dāng)培養(yǎng)至第1

40、8天，菌絲體呈現(xiàn)淡黃色，整個(gè)培養(yǎng)基的液體明顯減少，且呈粘稠狀，里面存在許多平菇的絮狀代謝物，同時(shí)菌絲體生物量有所減少，減少到0.3285g。</p><p>　　通過(guò)t檢驗(yàn)和觀察圖2，發(fā)現(xiàn)前16天各個(gè)點(diǎn)之間生物量具有顯著差異性（P<0.05），平菇菌絲體快速生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)提供菌絲體生長(zhǎng)。第16、18、20之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05），生物量緩慢下降。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基里的

41、營(yíng)養(yǎng)不足，菌絲體停止生長(zhǎng)，甚至發(fā)生自溶現(xiàn)象。 </p><p>　　所以平菇菌絲體在前期快速生長(zhǎng)，第10天菌絲體長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，當(dāng)培養(yǎng)至第16天，菌絲體達(dá)到最大值0.3315g，隨后生物量緩慢下降，第20天時(shí)，生物量下降至0.3214g。</p><p>　　圖2 平菇菌絲體在不同時(shí)期的生物量</p><p>　　4.1.2 平菇產(chǎn)脂情況分析</p>

42、<p>　　本實(shí)驗(yàn)采用酸熱法每?jī)商鞂?duì)平菇菌絲體內(nèi)脂肪進(jìn)行一次定量測(cè)定。平菇菌絲體內(nèi)脂肪含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)如圖3所示。在生長(zhǎng)初期，菌絲體內(nèi)脂肪含量上升，當(dāng)培養(yǎng)到第10天時(shí)候，脂肪含量達(dá)到最高值4.16%。然后開(kāi)始下降。 通過(guò)t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)第2天與第4天之間的脂肪含量具有顯著地差異性（P<0.05），可見(jiàn)，前4天的脂肪含量迅速增加，第4、6、8、10天之間的脂肪含量無(wú)顯著差異性（P>0.05），脂肪含量緩慢

43、增加。第10天，脂肪含量達(dá)到最大值。第12、14、16、18天之間的脂肪含量也沒(méi)有顯著差異性（P>0.05），脂肪含量慢慢減少。前4天脂肪含量迅速上升是由于生長(zhǎng)初期，菌體利用培養(yǎng)基內(nèi)豐富的碳氮源，細(xì)胞增殖，并快速合成積累脂肪[26]。一般情況下，培養(yǎng)基中含氮量高，則細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量也高且油脂積累量也比較高[23]。第4天后碳氮源逐漸減少，一定程度減緩了平菇油脂的合成速度。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間到第10天時(shí)，脂肪含量達(dá)到最高值。第10天以后脂肪

44、含量逐漸減少，是因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)元素已不足以供其生長(zhǎng)，所以平菇不得不以自身體內(nèi)的甘油三酯作為能源來(lái)維持生長(zhǎng)。</p><p>　　圖3 平菇菌絲體在不同時(shí)期的脂肪含量</p><p>　　除了測(cè)定平菇菌絲體內(nèi)脂肪含量，還測(cè)定了過(guò)濾后的培養(yǎng)基的脂肪含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)平行樣。首先測(cè)定培養(yǎng)基的空白樣，發(fā)現(xiàn)錐形瓶無(wú)增重。因?yàn)镵irk培養(yǎng)基是無(wú)機(jī)鹽配制的，土豆濾液作為復(fù)合型溶液，其脂肪含量是微量的

45、可以忽略不計(jì)。測(cè)定第2天和第4天的培養(yǎng)基瓶子分別增重0.0273g和0.0266g，錐形瓶底部有一點(diǎn)點(diǎn)油跡。測(cè)定第6天和第8天的培養(yǎng)基瓶子分別增重0.0125g和0.0294g.。測(cè)定第10天和第12天的培養(yǎng)基瓶子分別增重0.0162g和0.0158g。培養(yǎng)基內(nèi)具體脂肪含量變化見(jiàn)圖4。分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和觀察圖4，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基脂肪含量首先數(shù)值均很小、且各個(gè)數(shù)據(jù)之間相差較大，比較散亂，無(wú)一定的規(guī)律性。另外發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差都很大，準(zhǔn)確性不高，

46、這可能是由于實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)造成的。此外，培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中脂肪含量的增加可能是在菌絲體生長(zhǎng)階段通過(guò)菌絲產(chǎn)酶的結(jié)果。這些脂肪可用來(lái)合成子實(shí)體細(xì)胞壁[27]。若沒(méi)有子實(shí)體，合成的油脂會(huì)保留在培養(yǎng)基中，使得培養(yǎng)基內(nèi)脂肪含量增加[28]?？梢?jiàn)，培養(yǎng)基內(nèi)脂肪含量有待深入研究。</p><p>　　圖4 平菇培養(yǎng)基內(nèi)不同時(shí)間脂肪含量</p><p>　　4.1.3 平菇菌絲體蘇丹黑B染色結(jié)果分析</

47、p><p>　　采用蘇丹黑B染色法對(duì)平菇菌絲體進(jìn)行染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體的染色情況。通過(guò)觀察油脂粒大小和多少可以粗略判斷油脂含量。由于蘇丹黑B為重氮染料，能溶解于細(xì)胞內(nèi)的含脂結(jié)構(gòu)（如中性脂肪、磷脂、糖脂和類固醇），對(duì)菌體染色后，會(huì)使脂肪粒呈藍(lán)紫色或紫黑色。圖5為平菇菌絲體第4、10、16天的染色圖片。從圖中觀察發(fā)現(xiàn)第4天平菇菌絲體比較松散，存在藍(lán)黑色的脂肪粒，但是數(shù)量不多。第10天菌絲體形態(tài)清晰且比第4天

48、的菌絲體變得更加緊密，同時(shí)有很多紫黑色的脂肪粒存在。第16天的菌絲體內(nèi)同樣有許多脂肪粒存在，但是較10天略微減少。由此，我們可以定性地判斷平菇菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中存在脂肪的合成，且可以粗略地判斷脂肪含量先增加后減少，這與定量測(cè)定脂肪含量所呈現(xiàn)的結(jié)果是一樣的。</p><p>　　圖5 平菇菌絲體內(nèi)脂肪染色情況（1600×）</p><p>　　綜上所述，平菇菌絲體隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推移呈現(xiàn)

49、先增加后減少的規(guī)律。平菇菌絲體經(jīng)蘇丹黑B染色，在顯微鏡下可以清晰地觀察到一顆顆藍(lán)灰色的脂肪粒，定性地證明了平菇菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中存在脂肪合成現(xiàn)象。然后，通過(guò)酸熱法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌絲體內(nèi)脂肪隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間推移出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間到第10天時(shí)，脂肪含量達(dá)到最高值4.16%，后來(lái)由于培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)元素不足，菌絲體消耗自身物質(zhì)，導(dǎo)致脂肪含量下降。</p><p>　　4.2 營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)平菇產(chǎn)脂影響的分析</p&

50、gt;<p>　　4.2.1 Plackett-Burman法篩選影響培養(yǎng)基的主要因素</p><p>　　本文根據(jù)對(duì)平菇的研究，選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2這5個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素分別取低水平（-1）和高水平（+1）2個(gè)水平，每個(gè)因素的濃度用g/L表示，響應(yīng)值為油脂產(chǎn)率(Y)，單位為％。平行實(shí)驗(yàn)4次，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和

51、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6、表7。</p><p>　　表6 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值變化(N=12)</p><p>　　表7 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　通過(guò)Minitab 軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，獲得多元一次回歸方程：y = 9.03 + 0.0740 A - 1.36 B - 1.37 C - 0.637 D - 1

52、1.6 E。式中A、B、C、D、E分別代表葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2。</p><p>　　由表7可以看出該回歸模型的P值為0.001（P<0.005），說(shuō)明該模型顯著即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合良好。其次葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4這3個(gè)因素對(duì)平菇的脂肪含量影響最大，且葡萄糖對(duì)提高培養(yǎng)基內(nèi)脂肪含量具有顯著正效應(yīng)，酒石酸銨、KH2PO4、MgSO4&#

53、183;7H2O、CaCl2具有負(fù)效應(yīng)。按照影響的大小，各因素順序依次為KH2PO4、酒石酸銨、葡萄糖、MgSO4·7H2O、CaCl2。其中CaCl2對(duì)結(jié)果的影響最小，MgSO4·7H2O對(duì)結(jié)果影響較大，KH2PO4、酒石酸銨、葡萄糖對(duì)結(jié)果影響最大。</p><p>　　4.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)(Steepest ascent design)確定因素水平</p><p&g

54、t;　　由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選取葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4這3個(gè)對(duì)脂肪含量影響最顯著的因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。根據(jù)這3因素的效應(yīng)大小比較設(shè)定它們的變化方向和步長(zhǎng)，由于葡萄糖對(duì)平菇菌絲體中脂肪含量的影響呈正效應(yīng)，而酒石酸銨、KH2PO4呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，因此葡萄糖的量要依次減少，而酒石酸銨、KH2PO4的量要依次增加。依此，葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4這3個(gè)濃度的步長(zhǎng)分別取取-5，0.2，0.1，具體情況如表8所示。&

55、lt;/p><p>　　表8 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果</p><p>　　由表8可見(jiàn)，脂肪含量從上到下先增加后降低，呈現(xiàn)一個(gè)開(kāi)口向下的拋物線形狀，存在最大值即葡萄糖為10g/L、酒石酸銨為0.821 g/L和KH2PO4為0.8 g/L。故以第4組的實(shí)驗(yàn)條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。</p><p>　　4.2.3 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)確定主要因素的最優(yōu)水平

56、</p><p>　　根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)組，確定Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)的因素與水平，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)Design Expert軟件對(duì)平菇菌絲體內(nèi)脂肪含量的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，其具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9、表10。實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用以下回歸方程表示：Y=-107.20595+0.31819A+172.0750B+108.81562C</p><p>　

57、　+0.29375AB-0.12500AC+11.56250BC-0.024531A2-113.00000B2-68.35937C2。式子中A、B、C分別代表葡萄糖、酒石酸銨、KH2PO4。</p><p>　　據(jù)表10可知此模型P值小于0.0001，失擬性P值0.4064>0.05，說(shuō)明此模型在α=0.05水平上失擬不顯著，回歸高度顯著?；貧w模型的R2為0.9800，說(shuō)明該模型能夠解釋98.00%的變化，

58、擬合程度較好。此外，該模型的校正決定系數(shù)R2adj=0.9543，說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合良好，可以用于培養(yǎng)基對(duì)脂肪含量影響的分析。</p><p>　　表9 響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　表10 Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析表</p><p>　　圖6 響應(yīng)面法立體分析圖和相應(yīng)等高線圖</p&g

59、t;<p>　　其中6-1是當(dāng)KH2PO4=0.80g/L時(shí)，葡萄糖和酒石酸銨對(duì)脂肪含量的交互影響。6-2是當(dāng)酒石酸銨=0.82g/L時(shí)，葡萄糖與KH2PO4對(duì)脂肪含量的交互影響。6-3是當(dāng)葡萄糖=10g/L時(shí)，酒石酸銨和KH2PO4對(duì)脂肪含量的交互影響。</p><p>　　根據(jù)上述回歸方程及回歸模型方差分析表繪出雙因子效應(yīng)分析圖見(jiàn)圖6。由響應(yīng)面曲線圖6-1可見(jiàn)，當(dāng)葡萄糖濃度一定時(shí)，脂肪含量隨著酒

60、石酸銨的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，曲線變化明顯。當(dāng)酒石酸銨濃度一定時(shí)，脂肪含量隨著葡萄糖的增加先增加后減少。由響應(yīng)面曲線圖6-2可見(jiàn)，當(dāng)葡萄糖濃度一定時(shí)，KH2PO4逐漸上升，對(duì)應(yīng)的脂肪含量先增加后降低，增加程度較大，而后慢慢下降，下降程度不高，說(shuō)明脂肪含量在KH2PO4為較大值時(shí)達(dá)到最高值。當(dāng)KH2PO4濃度一定時(shí)，脂肪含量隨著葡萄糖增加先上升后下降，變化不明顯。由響應(yīng)面曲線圖6-3可見(jiàn)，當(dāng)酒石酸銨濃度一定時(shí)，隨著KH2PO4濃度的

61、上升，脂肪含量先增加然后再減少，曲線變化明顯，當(dāng)KH2PO4一定時(shí)，脂肪含量隨著酒石酸銨的上升先增加后減少，曲線變化較明顯。等高線呈圓形說(shuō)明兩因素交互作用不顯著，呈橢圓或者馬鞍形則表明作用顯著，而圖中顯示的3個(gè)等高線為橢圓或馬鞍形狀，說(shuō)明兩因素之間交互顯著，且反應(yīng)的結(jié)果均與回歸模型方差分析表一致。</p><p>　　根據(jù)表10和圖6可見(jiàn)，影響平菇產(chǎn)脂的主要因素為KH2PO4，次要因素為酒石酸銨和葡萄糖。KH2P

62、O4作為無(wú)機(jī)鹽，適當(dāng)?shù)丶尤肱囵B(yǎng)基內(nèi)能夠促進(jìn)平菇菌絲體內(nèi)脂肪的合成和積累。這個(gè)與國(guó)外學(xué)者研究構(gòu)巢曲霉發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中適當(dāng)調(diào)整Na+、K+、Mg2 +、SO42 -、PO43 -等離子的含量比，提高菌體油脂含量[29]相符合。同時(shí)KH2PO4可以作為緩沖液，使菌絲體處在最佳的pH環(huán)境。酒石酸銨作為一種無(wú)機(jī)氮源，有利于不飽和脂肪酸的合成和積累。根據(jù)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，脂肪含量隨著氮源增加而增加，且酒石酸銨為0.82g時(shí)，脂肪含量達(dá)到最

63、高值?？梢?jiàn)平菇菌絲體對(duì)氮源需求高，在較高氮源情況下平菇菌絲體才能良好地生長(zhǎng)、更好地進(jìn)行脂肪的合成和積累。葡萄糖被研究為是菌絲體細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳碳源，同時(shí)也是菌體油脂合成的最適碳源[29]。平菇脂肪含量隨著葡萄糖增加先增高后減少，在9.2g時(shí)達(dá)到最高值。此后油脂含量逐漸減少，是因?yàn)槠咸烟菨舛冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致菌體自身的代謝異常旺盛，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，影響到微環(huán)境的pH以及葡萄糖的代謝產(chǎn)物抑制其他產(chǎn)物的合成。另外從C/N比來(lái)看，不同的碳氮比對(duì)真

64、菌油脂的合成和積累有顯著</p><p>　　綜上所述，可以確定KH2PO4對(duì)平菇菌絲體脂肪含量的影響具有顯著性，酒石酸銨、葡萄糖次之。通過(guò)Design-Expert軟件分析得出當(dāng)葡萄糖9.2g、酒石酸銨0.82g、KH2PO40.86g時(shí)，理論上可獲得最高脂肪含量11.36％，生物量為0.3315g。</p><p><b>　　5 討論</b></p>

65、<p>　　本實(shí)驗(yàn)主要研究平菇生長(zhǎng)過(guò)程中的脂肪規(guī)律，發(fā)現(xiàn)脂肪含量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)先增加后減少。影響脂肪含量的因素多且復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中溫度、pH、濕度基本保持不變，下面將從菌體培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞密度這兩方面進(jìn)行討論。在菌絲體脂肪含量變化中，細(xì)胞合成油脂的最佳時(shí)間與菌種所處生長(zhǎng)階段和培養(yǎng)時(shí)間都有關(guān)系。時(shí)間過(guò)短，真菌油脂還沒(méi)有完全形成，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體細(xì)胞自溶或菌絲體不再形成，只有在適宜的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，才能達(dá)到最佳的產(chǎn)油脂狀態(tài)。

66、通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們了解到平菇菌絲體在前十天（生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期）油脂含量急劇增加，在第10天（對(duì)數(shù)期中后期）脂肪含量達(dá)到最大值，第10天以后（穩(wěn)定期）脂肪含量逐漸下降。因此，我們可以通過(guò)觀察菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)判斷所處生長(zhǎng)階段，然后可以粗略判斷脂肪含量。細(xì)胞密度一定程度上也對(duì)脂肪含量產(chǎn)生影響，適當(dāng)?shù)脑黾蛹?xì)胞密度可以提高油脂的含量，密度過(guò)高則會(huì)影響油脂產(chǎn)率[30]。在植菌的時(shí)候，我們通常使用已滅菌地直徑1㎝的打孔器和刮刀在超凈臺(tái)內(nèi)將菌塊植入到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，菌

67、塊的大小決定了細(xì)胞密度。那么如果適當(dāng)改變實(shí)驗(yàn)所需的打孔器的直徑，平菇油脂產(chǎn)率應(yīng)該也會(huì)有所影響。適當(dāng)?shù)木鷫K大小不僅可以提高油脂產(chǎn)量，而且減少雜菌污染</p><p>　　此外，通過(guò)對(duì)比生物量和脂肪含量的折線圖（圖7），發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的前10天，平菇菌絲體的生物量和脂肪含量均呈上升趨勢(shì)，脂肪含量在第10天達(dá)到最高值，然后第10～16天，生物量繼續(xù)上升，并達(dá)到最大值，與此同時(shí)脂肪含量開(kāi)始降低。第16天之后，生物量開(kāi)始減少，不

68、過(guò)減少程度很低而脂肪含量逐漸趨于平衡。剛開(kāi)始平菇菌絲體利用培養(yǎng)基內(nèi)豐富的營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)行細(xì)胞增殖和脂肪的合成與積累，導(dǎo)致生物量和脂肪含量快速上升。中期由于培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不足，菌絲體開(kāi)始消耗自身體內(nèi)油脂維持菌絲體生長(zhǎng)，導(dǎo)致脂肪含量緩慢下降。最后，由于空間有限和能源的不足，菌絲體停止增長(zhǎng)，脂肪含量基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。第16天以后生物量減少可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞變形，并且出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[21]。</p><p>　　圖7

69、生物量和脂肪含量的變化圖</p><p><b>　　6 結(jié)論</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用液體培養(yǎng)法，在Kirk培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)平菇菌絲體。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加平菇菌絲體出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，并且在第16天的時(shí)候，菌絲體達(dá)到最高值。此外，采用蘇丹黑B染色法對(duì)平菇菌絲體進(jìn)行染色，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)數(shù)量較多的藍(lán)紫色或藍(lán)黑色的形態(tài)分明的脂肪粒存在。另一方面采用酸熱法定

70、量測(cè)定脂肪含量，結(jié)果表明脂肪含量先增加后減少最后趨于平穩(wěn)，且在培養(yǎng)的第10天時(shí)，脂肪含量達(dá)到最大值。平菇培養(yǎng)基中的脂肪含量有大有小，數(shù)據(jù)散亂，無(wú)一定的規(guī)律性，可見(jiàn)培養(yǎng)基中的脂肪含量有待進(jìn)一步研究。</p><p>　　接下來(lái)依次使用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最優(yōu)培養(yǎng)基。由表8和三維分析圖可以看出對(duì)平菇菌絲體產(chǎn)脂影響大小依次為KH2PO4、酒石酸銨、葡萄糖。通過(guò)Box-Be

71、nhnken Design 軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析得出當(dāng)葡萄糖9.2g/L、酒石酸銨0.82g/L、KH2PO40.86g/L時(shí)，理論上可獲得最高脂肪含量11.36％。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，對(duì)于控制在白腐真菌處理有機(jī)固廢后的菌糠中的脂肪含量奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 張愛(ài)武,董 斌,康 偉.白腐真菌對(duì)秸稈的降解效果及

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74、王麗蘋(píng).秸稈飼料的加工調(diào)制利用技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2007(10):152.</p><p>　　[8] Liang Z, Han B P. White-rot fungus growth conditions and its metabolic kinetic models[J]. Agricultural Science& Technology, 2008, 9(6):109.</p>

75、;<p>　　[9] Hu C Q, Zhang L L, Huang M Y, et al. Effects of material physical properties on white-rot fungi mycelial growth[J]. Agricultural Science& Technology, 2009, 10(5):26-29.</p><p>　　[10] 胡長(zhǎng)

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77、Archives of Microbiology,1978,117(3):277-285.</p><p>　　[12] 謝慧芳,近藤隆一郎,李忠正.白腐菌Phanerochaete sordida YK-624產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶的生產(chǎn)及初步純化[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2003,23(4):22-26.</p><p>　　[13] 史海粟,王際輝,葉淑紅等.產(chǎn)功能性油脂微生物的篩選及鑒定[J

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79、:14</p><p><b>　　-18.</b></p><p>　　[16] Terebiznik M.R.Biomass estimation in solid state fermentation by modeling dry matter weight loss[J]. Biotechnology Tech-niques, 1999, (13):215-

80、219.</p><p>　　[17] ] GB/T 5009.6-2003.食品中脂肪的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.</p><p>　　[18] 孔凡敏,趙祥穎,田延軍等.酸熱法提取酵母油脂條件的研究[J].2010(5):143-146.</p><p>　　[19] 郝學(xué)財(cái),余曉斌,劉志鈺等.響應(yīng)面法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J].食品研

81、究與開(kāi)發(fā),</p><p>　　2006,27(1):39-42.</p><p>　　[20] 馬麗娟,邢大輝,王紅蕾等.培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)油微生物生長(zhǎng)的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2009,25</p><p>　　(1):55-59.</p><p>　　[21] 易紹金,鄭義平.產(chǎn)油微生物的研究及其應(yīng)用[J].中外能源,2006,11(2):

82、90-94.</p><p>　　[22] 相光明,劉建軍,趙祥穎等.產(chǎn)油微生物研究及應(yīng)用[J].糧食與油脂,2008(6):7-11.</p><p>　　[23] 張麗霞,王興國(guó).微生物不飽和油脂研究[J].糧食與油脂,2007(6):20-22.</p><p>　　[24] 應(yīng)惟媧,郝玉有,儲(chǔ)炬等.響應(yīng)面法優(yōu)化紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基[J].中國(guó)抗生素雜志,2009

83、,34(5)</p><p><b>　　:272-276.</b></p><p>　　[25] 曹小紅,蔡萍,李凡等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus natto TK-1產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基[J].中國(guó)生物工程雜志,2007,27(4):59-61.</p><p>　　[26] 薛飛燕,張 栩,譚天偉.微生物油脂的研究進(jìn)展及展望[J].生物

84、加工過(guò)程,2005,3(1):23-27.</p><p>　　[27] Nair NG, Song CH, Jiang JY, Vine JH, Tattum B, Cho KY (1989) Lipid profile of Pleurotus sajor caju[J]. Ann Appl Biol 114:167–176. </p><p>　　[28] Abu OA, Tewe

85、OO, Losel DM, Onifade AA (2000) Changes in lipid, fatty acids and protein composition of sweet potato (Ipomoea batatas) after solid-state fungal fermentation[J]. Bioresour Technol 72:189–192.</p><p>　　[29] 耿

86、青偉.幾種優(yōu)質(zhì)產(chǎn)油真菌的篩選及發(fā)酵工藝研究[D].南京林業(yè)大學(xué)研究生碩士學(xué)位論文. 2009.</p><p>　　[30] 林金濤,沈宏偉,張澤會(huì)等.圓紅冬孢酵母兩階段培養(yǎng)法生產(chǎn)微生物油脂[J].生物工程學(xué)報(bào), 2010,26(7):997–1002.</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　從去年的選題、實(shí)驗(yàn)到寫(xiě)論

87、文，胡老師都給予了我極大的幫助。在實(shí)驗(yàn)方面，老師給了我很多的指導(dǎo)，讓我以應(yīng)有的專業(yè)素養(yǎng)認(rèn)真對(duì)待實(shí)驗(yàn)。當(dāng)我在寫(xiě)論文遇到麻煩時(shí)，胡老師給我理清思路，指明方向。在論文指導(dǎo)過(guò)程中，可以深刻地感受到胡老師對(duì)工作認(rèn)真、負(fù)責(zé)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度。他的這些精神深深地影響著我，將使我受益終身。在此，特向胡老師致以我最衷心的謝意。其次，我還要感謝那些和我一起做實(shí)驗(yàn)的同學(xué)，感謝他們平時(shí)對(duì)我的關(guān)心和幫助，有了他們我的實(shí)驗(yàn)生活變得更加的豐富多彩，這些將是我人生中美好的回

88、憶。</p><p>　　最后，我要對(duì)四年相處過(guò)的同學(xué)和教育過(guò)我的老師表示感謝，有了你們我的大學(xué)生活變得美好。同時(shí)向參加論文評(píng)閱、評(píng)議及答辯組的老師們，致以誠(chéng)摯的謝意！</p><p>　　附錄3 脂肪的國(guó)標(biāo)測(cè)定方法</p><p>　　脂肪測(cè)定的國(guó)標(biāo)規(guī)定方法 GB/T 5009.6-2003</p><p><b>　　原理<

89、;/b></p><p>　　試樣經(jīng)酸水解后用乙醚提取，除去溶劑即得總脂肪含量，酸水解法測(cè)得的為游離及結(jié)合脂肪的總量。</p><p><b>　　試劑</b></p><p><b>　　1 鹽酸。</b></p><p>　　2 乙醇（95%）。</p><p>&

90、lt;b>　　3 乙醚。</b></p><p>　　4 石油醚（30℃～60℃沸程）。</p><p><b>　　儀器</b></p><p>　　100mL具塞刻度量筒。</p><p><b>　　分析步驟</b></p><p>　　1 按以下方法

91、進(jìn)行試樣處理</p><p>　　1.1 固體試樣：稱取約2.00g的試樣置于50mL大試管內(nèi)，加8mL水，混勻后再加10mL鹽酸。</p><p>　　1.2 液體試樣：稱取10.00g，置于50mL大試管內(nèi)，加10mL鹽酸。</p><p>　　2 將試管放入70℃～80℃水浴中，每隔5min～10min以玻璃棒攪拌一次，至試樣消化完全為止，約40min～50m

92、in。</p><p>　　3 取出試管，加入10mL乙醇，混合。冷卻后將混合物移入100mL具塞量筒中，以25mL乙醚分次洗試管，一并倒入量筒中。待乙醚全部倒入量筒后，加塞振搖1min，小心開(kāi)塞，放出氣體，再塞好，靜置12min，小心開(kāi)塞，并用石油醚-乙醚等量混合液沖洗塞及筒口附著的脂肪。靜置10min～20min，待上部液體清晰，吸出上清液于已恒量的錐形瓶?jī)?nèi)，再加5mL乙醚于具塞量筒內(nèi)，振搖，靜置后，仍將上層

93、乙醚吸出，放入原錐形瓶?jī)?nèi)。將錐形瓶置水浴鍋上蒸干，置100℃±5℃烘箱中干燥2h，取出放干燥器內(nèi)冷卻0.5h后稱量，重復(fù)以上操作直至恒量。</p><p><b>　　計(jì)算</b></p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　——試樣中粗脂肪的含量，單位為克每百克（g/100g）；</p

94、><p>　　——接收瓶和粗脂肪的質(zhì)量，單位為克（g）；</p><p>　　——接收瓶的質(zhì)量，單位為克（g）；</p><p>　　——試樣的質(zhì)量（如是測(cè)定水分后的試樣，則按測(cè)定水分前的質(zhì)量計(jì)），單位為克（g）；</p><p>　　計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后一位。</p><p><b>　　精密度</b&