植物保護學(xué)科前沿論文

1、<p><b>　　中國農(nóng)業(yè)大學(xué)</b></p><p><b>　　課程論文</b></p><p>　　論文題目： 分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲分類中的應(yīng)用</p><p>　　課程名稱：植物保護學(xué)科前沿 </p><p>　　任課教師： 彭友良 &l

2、t;/p><p>　　班　　級： 植物保護11班 </p><p>　　學(xué)　　號： SY13010062 </p><p>　　姓　　名： 衛(wèi)玉鋒 </p><p>　　分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲分類中的應(yīng)用</p><p>　　摘要：隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)

3、展,生物技術(shù)已越來越多地被應(yīng)用在昆蟲分類學(xué)研究中。本文概述了核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子雜交、SSCP及DSCP等生物技術(shù)在昆蟲分類研究中的應(yīng)用情況,并展望了分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲分類研究中的前景。</p><p>　　關(guān)鍵詞:分子生物學(xué)技術(shù);昆蟲分類</p><p>　　目前,已經(jīng)定名的昆蟲有100多萬種,占已知動物的2 /3,但是全世界仍約有90%的昆蟲是未知種[ 1 ]。隨著

4、科學(xué)技術(shù)的進步以及各個學(xué)科的交叉滲透,已有200多年歷史的昆蟲分類學(xué)也獲得了極大的發(fā)展,特別是現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用更加速了昆蟲分類學(xué)發(fā)展的步伐。長期以來,昆蟲分類主要是以外部形態(tài)特征為依據(jù)。因為外部形態(tài)特征較為直觀,且容易掌握,而根據(jù)昆蟲的形態(tài)特征作為分類依據(jù)在目等分類單元中可以很好的反映物種的分類地位。但是,在小的分類單元,如屬、族、種內(nèi)則不容易確定物種的分類地位,再到種群、生態(tài)型則更難確定分類地位。20世紀70年代以來,先后出現(xiàn)了核酸

5、序列分析、隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD) 、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP) 、分子雜交技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)及雙鏈構(gòu)象多態(tài)性(DSCP)技術(shù)等多種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),極大的促進了昆蟲分類學(xué)的發(fā)展。</p><p><b>　　1 研究及應(yīng)用現(xiàn)狀</b></p><p>　　核酸序列(線粒體DNA和核糖體DNA)分析技術(shù)</p><p

6、>　　線粒體DNA為雙鏈閉環(huán)分子。昆蟲的線粒體DNA大小為1514～1613 kb,其中含有編碼2個核糖體RNA (12S rRNA, 16S rRNA) 、22個t RNA、1個細胞色素b、3個細胞色素氧化酶(CO I、CO II、COIII) 、6個NADH降解酶(ND 1～6)和2個ATP酶(6和8)的基因[ 2 ] 。目前,通常用于昆蟲分類研究的基因有以下幾種: 16S rRNA、細胞色素b、ND2、COI、CO II等。

7、</p><p>　　潘興麗等以線粒體細胞色素b (Cyt b)基因作為分子標記,首次對緣蝽科4亞科14種昆蟲進行序列測定,獲得Cyt b基因412 bp 的序列片段。以篩豆龜蝽為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,表明在亞科級關(guān)系上,姬緣蝽亞科最原始,蛛緣蝽亞科次之,巨緣蝽亞科和緣蝽亞科親緣關(guān)系較近[3] 。姚銀花等通過對我國大螟S esam ia inferens 9 個地理種群的線粒體DNA CO II基因的測序,并分析了

8、大螟不同地理種群之間的CO II序列的遺傳分歧及相似性,同時建立其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[4] 。</p><p>　　核糖體DNA是編碼核糖體RNA的基因,是一類中度重復(fù)的DNA序列,以串聯(lián)多拷貝形式存在于染色體DNA 中。每個重復(fù)單位由非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (NTS) 、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)( ITS)和3 種RNA ( 18S、518S、28S RNA)基因編碼區(qū)組成[ 5 ] 。由于rDNA是生物界普遍存在的遺傳結(jié)構(gòu),具有多拷貝性、

9、編碼區(qū)保守、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)中度保守等優(yōu)點,因而在個體及群體內(nèi)有較好的均一性,少量樣品能有效代表其來源群體的rDNA的變異情況。因此, rDNA已成為生物系統(tǒng)進化研究中一個非常有用的分子標記[6] 。</p><p>　　Flook和Rowell測定了29 種多新翅類( Polyneop tera)昆蟲的18S rDNA 的全序列,并結(jié)合Gen2Bank數(shù)據(jù)庫中的8 種其它昆蟲的18S rDNA 全序列,重建了傳統(tǒng)的古

10、翅亞部( Palaeop tera)和新翅亞部(Neop tera)昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育,其結(jié)果支持直翅目的單系性[ 7 ] 。劉殿鋒等人測定了斑腿蝗科(Catantop idae) 10亞科20種蝗蟲和其它蝗科3種蝗蟲的線粒體16S rDNA 部分序列,并從GenBank中下載了蝗亞目(Locustodea) 15個種的16S rDNA相應(yīng)序列片段,構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,但分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果和基于形態(tài)特征的斑腿蝗科傳統(tǒng)分類結(jié)果有很大的不同[8]

11、 。</p><p>　　1.2 RAPD 和RFLP技術(shù)</p><p>　　RAPD技術(shù)是由美國杜邦公司的科學(xué)家Williams和加利福尼亞生物研究所Welsh兩個研究小組在1990發(fā)展起來的以PCR為基礎(chǔ)的一項DNA分子水平上的大分子多態(tài)檢測技術(shù)[ 9 ]。其原理是用隨機序列的9 - 10個核苷酸的引物對基因組的DNA進行PCR擴增,再進行電泳分離與溴化乙錠染色。RAPD 技術(shù)具有簡

12、便、快捷、靈敏、多態(tài)性檢出率高、所需DNA量少等特點,因此被迅速用于個體和品系鑒定、基因的多態(tài)分析、基因定位、構(gòu)建遺傳圖譜、標記輔助選擇和種間遺傳分析等領(lǐng)域的研究。目前RAPD技術(shù)已成為昆蟲遺傳圖譜構(gòu)建中的一種普遍方法,該技術(shù)一出現(xiàn),就被用于蚊蟲的分子系統(tǒng)學(xué)研究。</p><p>　　南宮自艷等采用RAPD技術(shù),分析了5種松毛蟲10個地理種群的種群內(nèi)、種群間的遺傳多樣性,檢測和描述在不同地理環(huán)境條件下的松毛蟲種群

13、的遺傳結(jié)構(gòu)和變異情況,為松毛蟲的綜合防治提供有效的依據(jù)[ 10 ] 。趙慧婷等采用RAPD 技術(shù)對來自中國境內(nèi)8個省市的28群東方蜜蜂Apis cerana進行了研究,探討了它們之間的親緣關(guān)系[ 11 ] 。</p><p>　　RFLP技術(shù)(限制性片段長度多態(tài)性分析)是由Bostein在1980年首先建立并發(fā)展起來的一種分子遺傳標記技術(shù)。它是指應(yīng)用限制性內(nèi)切酶切割不同類群個體基因組DNA或某一基因,產(chǎn)生不同長度

14、的限制性片段,根據(jù)酶切圖譜,計算類群之間的遺傳距離,構(gòu)建系統(tǒng)樹。賈正輝等應(yīng)用PCR - RFLP技術(shù)對來自四川省8個地方的枯死松樹樣品中的傘滑刃屬線蟲群體進行了分子鑒定。該研究中選用的4種限制性內(nèi)切酶(DraⅠ、SalⅠ、HhaⅠ、AluⅠ)除SalⅠ外均可對所鑒定的6種傘滑刃屬線蟲產(chǎn)生特異性的酶切位點,從而均可有效地鑒別出松材線蟲、擬松材線蟲和其他4種傘滑刃屬線蟲,其結(jié)果可為今后這幾種傘滑刃屬線蟲的分子鑒定提供一定的參照[12] 。&

15、lt;/p><p><b>　　1.3分子雜交技術(shù)</b></p><p>　　核酸的分子雜交技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中常用的方法之一,它和克隆技術(shù)密不可分,并且在基因表達、調(diào)控以及在物種親緣關(guān)系的研究中具有重要作用。最基本的分子雜交技術(shù)包括原位雜交技術(shù)、Northern分子雜交技術(shù)和Southern分子雜交技術(shù)。在昆蟲學(xué)研究主要應(yīng)用核酸分子技術(shù)檢測起遺傳的多態(tài)性、DNA

16、的同緣性和mRNA的差異來鑒別昆蟲的近緣種以及地理種群。分子雜交的關(guān)鍵是制備特異性強和靈敏度高的探針。目前應(yīng)用較多的是地高辛和生物素等非放射性標記探針。Lorite等利用原位雜交對葉甲科Chrysomelidae昆蟲Chrysolinaam ericana的微衛(wèi)星進行了研究[13 ] 。</p><p>　　1.4SSCP和DSCP技術(shù)</p><p>　　SSCP技術(shù)(單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

17、)及DSCP技術(shù)(雙鏈構(gòu)象多態(tài)性分析)的基本原理相似,都是依據(jù)DNA分子在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時,其遷移率除與DNA的長短有關(guān)外,更主要的是取決于DNA鏈所形成的構(gòu)象。SSCP技術(shù)自1989年由Masato Orita等人建立以來,就以其靈敏性廣受關(guān)注。李石柱等就使用PCR - SSCP技術(shù)對我國多斑按蚊復(fù)合體5個成員種進行了分子鑒別,分析其28S - D3擴增產(chǎn)物,結(jié)果顯示電泳條帶具種特異性,可用于鑒別各蚊種[ 14

18、] 。DSCP技術(shù)在昆蟲分類上的應(yīng)用不多,在國內(nèi)未見有相關(guān)報道。</p><p><b>　　2.問題與展望</b></p><p>　　隨著核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子雜交、SSCP及DSCP等分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲分類研究中的應(yīng)用和有益探索,或是解決了傳統(tǒng)分類中所存在的學(xué)術(shù)疑難問題,或是驗證了傳統(tǒng)分類所得出的結(jié)論,已顯示出其應(yīng)有的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。&l

19、t;/p><p>　　然而分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲研究中的應(yīng)用時間畢竟不長,還存在不少問題。首先是目的基因或DNA片段的選擇,如何在龐大的昆蟲DNA文庫中選擇最有利于昆蟲分類、最能反映其進化關(guān)系的基因或DNA片段,仍存在較大難度。其次是用不同的目的基因或DNA片段對同一昆蟲進行研究,可能會得到不同的結(jié)果。再次是分析軟件或程序包的應(yīng)用,目前有大量的分子生物學(xué)分析軟件,不同的軟件或程序包有許多不同的假設(shè)和參數(shù),研究者采用不同

20、的分析軟件或采用同一軟件而設(shè)置不同的參數(shù),同樣的數(shù)據(jù)可能會得到不同的結(jié)果。如何解決好這些問題是今后昆蟲分類科學(xué)研究工作中的重要任務(wù)。</p><p>　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,實驗技術(shù)的不斷發(fā)展和改進,它必然會推動昆蟲學(xué)在分子水平上的發(fā)展。昆蟲分類學(xué)是昆蟲學(xué)研究中的基礎(chǔ)領(lǐng)域,也是傳統(tǒng)領(lǐng)域,可以預(yù)見在不遠的將來,古老的昆蟲研究隨著不斷創(chuàng)新的理論和技術(shù)的發(fā)展,將有新的更大的成就。</p><

21、;p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[ 1 ]袁鋒. 研究內(nèi)容和發(fā)展[A ].昆蟲分類學(xué)[M ] .北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1996, 1 – 6.</p><p>　　[ 2 ] Flook P K, Rowell C H F, Gellissen .The sequence, organizationand evolution of t

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25、lution from small subunit nuclear ribosomal DNAsequences[ J ]InsectMolecular Biology, 1998, 7 (2) : 163 – 178.</p><p>　　[ 8]劉殿鋒,蔣國芳,時號等.應(yīng)用16S rDNA序列探討斑腿蝗科的單系性及其亞科的分類地位[ J ].昆蟲學(xué)報, 2005, 48 ( 5) : 759- 769.<

26、;/p><p>　　[ 9 ]Williams J G K, Kubelik A R. DNA polymorphisms amp lified byarbitrary p rimers are useful as genetic markers [ J ] NucAcidsRes, 1990, 18 (22) : 6531 – 6535.</p><p>　　[ 10]南宮自艷,高寶嘉,徐志

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28、的PCR- RFLP鑒別[ J ].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2012, 26 ( 2 ) : 205 -209.</p><p>　　[ 13 ]Lortie P, Palomeque T, Garner I, et al1 Characterization and chro2mosome location of satellite DNA in the leaf beetle Chrysolina am eri2c