褐飛虱RDL亞基多態(tài)性分析及與氟蟲(chóng)腈抗性之間的關(guān)系研究.pdf

1、褐飛虱Nilaparvata luges St(a)l（Brown planthopper,BPH）是危害水稻最嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一，生產(chǎn)上主要以化學(xué)防治為主。但是長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)化學(xué)藥劑的依賴，導(dǎo)致了褐飛虱對(duì)各種長(zhǎng)期使用的常規(guī)殺蟲(chóng)劑甚至新型的殺蟲(chóng)劑都已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性。氟蟲(chóng)腈是防治褐飛虱的重要?dú)⑾x(chóng)劑之一，但是前期研究發(fā)現(xiàn)田間褐飛虱普遍對(duì)氟蟲(chóng)腈的敏感性明顯下降，很多地區(qū)的田間種群甚至產(chǎn)生了高水平的抗性。為了進(jìn)一步了解褐飛虱對(duì)氟蟲(chóng)腈的抗藥性機(jī)制，建

2、立有效的抗藥性治理策略，提高藥劑的藥效和合理使用方法，本文通過(guò)田間褐飛虱的抗性生物測(cè)定、室內(nèi)敏感品系的誘變、氟蟲(chóng)腈高劑量篩選，分析篩選試蟲(chóng)靶標(biāo)基因序列的多態(tài)性變化，鑒定關(guān)鍵多態(tài)性位點(diǎn)，并通過(guò)外源表達(dá)分析了多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸變化對(duì)氟蟲(chóng)腈敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)了GABA受體Rdl亞基的抗藥性相關(guān)的功能突變位點(diǎn)。具體結(jié)果匯報(bào)如下。
　　一、褐飛虱對(duì)氟蟲(chóng)腈的抗藥性調(diào)查
　　對(duì)2010年采自南寧等12個(gè)地區(qū)的褐飛虱田間種群進(jìn)行了抗藥性

3、監(jiān)測(cè)，并以室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)多年的敏感品系作為敏感基線，以改進(jìn)的稻莖浸漬法作為生物測(cè)定方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12個(gè)田間褐飛虱種群均已對(duì)氟蟲(chóng)腈產(chǎn)生了明顯的抗性，以南京等5個(gè)地區(qū)的抗性更為顯著，其中南京地區(qū)的田間褐飛虱種群對(duì)氟蟲(chóng)腈的抗性已達(dá)到了65.74倍。可見(jiàn)，不同地區(qū)褐飛虱種群均已經(jīng)對(duì)氟蟲(chóng)腈產(chǎn)生了高水平抗性，部分地區(qū)抗性水平超過(guò)50倍，而且地區(qū)之間存在較大差異。這說(shuō)明了田間褐飛虱種群對(duì)氟蟲(chóng)腈抗性發(fā)展迅速。2010年褐飛虱對(duì)氟蟲(chóng)腈抗性的快速上升，可能

4、與2007-2009年間氟蟲(chóng)腈大量應(yīng)用于褐飛虱防治有關(guān)，說(shuō)明高效殺蟲(chóng)劑的連續(xù)單一使用，很容易導(dǎo)致害蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生，與褐飛虱對(duì)吡蟲(chóng)啉抗性發(fā)展相一致。
　　二、田間褐飛虱RDL亞基功能區(qū)氨基酸多態(tài)性分析
　　根據(jù)已有的褐飛虱Rdl亞基核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，并采用降落PCR與半巢式PCR相結(jié)合的技術(shù)擴(kuò)增了褐飛虱室內(nèi)敏感品系與28個(gè)不同地區(qū)的田間抗性種群GABA受體Rdl亞基功能區(qū)的cDNA片段，測(cè)序并進(jìn)行序列對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

5、，在檢測(cè)的28個(gè)地理種群中，有21個(gè)地區(qū)的種群發(fā)生了不同數(shù)量的氨基酸替換，并且有部分氨基酸多態(tài)性在不同地區(qū)的褐飛虱種群中都有發(fā)生。選取抗性水平較高、多態(tài)性較多的3個(gè)種群（福州、南京、重慶）進(jìn)行了高劑量篩選和多態(tài)性變化研究，發(fā)現(xiàn)了R282Q、A284G、Y258S和A284S多態(tài)性在篩選后得到不同程度的增加，部分多態(tài)性發(fā)生在氟蟲(chóng)腈結(jié)合區(qū)域（跨膜片段TM1-TM3）上，預(yù)示著這些氨基酸替換可能在抗藥性中起重要作用。
　　三、室內(nèi)褐飛虱

6、誘變品系RDL亞基功能區(qū)氨基酸多態(tài)性分析
　　利用紫外照射和秋水仙素兩種誘變方法對(duì)室內(nèi)褐飛虱種群進(jìn)行誘變，并對(duì)誘變品系進(jìn)行高劑量氟蟲(chóng)腈篩選，然后對(duì)篩選出來(lái)的褐飛虱進(jìn)行Rdl亞基功能區(qū)序列測(cè)定并與敏感品系序列相對(duì)比。結(jié)果在Rdl亞基的第二跨膜區(qū)域發(fā)現(xiàn)了2個(gè)氨基酸替換（R282Q和M293I），并且其中一個(gè)氨基酸替換(R282Q)在田間種群中也發(fā)生了同樣的突變。由此分析認(rèn)為，這一突變很可能與褐飛虱膜蛋白的結(jié)合能力下降以及氟蟲(chóng)腈靶標(biāo)抗性

7、有關(guān)。
　　四、氨基酸多態(tài)性在褐飛虱對(duì)氟蟲(chóng)腈選擇性中的影響
　　針對(duì)田間種群和誘變種群中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵位點(diǎn)突變，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行敏感型和突變型Rdl受體表達(dá)，檢測(cè)Y258S、R282Q、A284S、A284G以及R282Q/A284S氨基酸替換對(duì)氟蟲(chóng)腈敏感性的影響。利用雙電極電壓鉗記錄技術(shù)，記錄了突變對(duì)GABA反應(yīng)和氟蟲(chóng)腈對(duì)GABA反應(yīng)抑制作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)氟蟲(chóng)腈的敏感性與敏感型受體相比，Y258S和R282Q的影

8、響相對(duì)較小;A284S和A284G使靶標(biāo)對(duì)氟蟲(chóng)腈的敏感性下降到了另一個(gè)新的水平;而R282Q/A284S氨基酸替換使得靶標(biāo)對(duì)氟蟲(chóng)腈的敏感性大大降低，這不僅說(shuō)明A284氨基酸突變?cè)诤诛w虱對(duì)氟蟲(chóng)腈的抗性中起重要的作用，而且預(yù)示著，田間種群的靶標(biāo)變異可能不僅僅來(lái)自于單個(gè)氨基酸替換，可能是多個(gè)氨基酸替換的共同效果。
　　因此，本研究對(duì)氟蟲(chóng)腈抗性的分子機(jī)制的理解具有重要意義，進(jìn)一步明確田間種群主效靶標(biāo)變異后，可以應(yīng)用于褐飛虱對(duì)氟蟲(chóng)腈及其類似