冬季寧波高教園區(qū)內(nèi)河浮游病毒豐度和形態(tài)多樣性調(diào)查【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：冬季寧波高教園區(qū)內(nèi)河浮游病毒豐度和形態(tài)多樣性調(diào)查</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào)

2、 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠(chéng)信承諾書(shū)</p><p>　　1．本人承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)），是在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下嚴(yán)格按照學(xué)校和學(xué)院有關(guān)規(guī)定完成的，引用他人的觀

3、點(diǎn)和參考資料均加以注釋和說(shuō)明。</p><p>　　2．本人鄭重地承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）沒(méi)有抄襲他人研究（設(shè)計(jì)）成果和偽造相關(guān)數(shù)據(jù)等行為。</p><p>　　3．畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）若有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。</p><p>　　學(xué)生簽名： __________</p><p>　　日 期： ______

4、____</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用電鏡及熒光顯微技術(shù)，于2010年1月（冬季）對(duì)寧波高教園區(qū)附近的鄞州體育館、鄞州公園、高教園區(qū)公園和萬(wàn)里學(xué)院四個(gè)站點(diǎn)的內(nèi)河的浮游病毒豐度及形態(tài)多樣性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，調(diào)查期間寧波高教園區(qū)內(nèi)河中浮游病毒的豐度達(dá)到105個(gè)/mL，鄞州體育館是四個(gè)站點(diǎn)中污染程度最高的，而鄞州公園污

5、染程度最低。寧波高教園區(qū)內(nèi)河水環(huán)境中浮游病毒不僅豐度高，而且形態(tài)多樣性豐富。近岸人類活動(dòng)的陸源污染是造成病毒數(shù)量分布特征的主要原因。水溫、pH值及溶氧是制約浮游病毒豐度的主要影響因素。</p><p>　　關(guān)鍵詞：寧波高教園區(qū)內(nèi)河；冬季；浮游病毒；豐度；形態(tài)；</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In Ja

6、nuary 2010, an investigation was made on the abundance and morphological diversity of virioplankton in the inland of YinZhou stadium, YinZhou park, higher education park and WanLi university in NingBo higher education zo

7、ne. The abundance and morphological diversity of virioplankton was measured by fluorescence microscopy and electron microscopy. Experimental results show that virioplankton abundance during investigation reached to 105ce

8、lls/mL. And we knew that the YinZhou stadium is the hig</p><p>　　Key Words: NingBo Higher Education Zone inland; Winter; Virioplankton ; Abundance ; Morphological Diversity ;</p><p><b>　　

9、目 錄</b></p><p><b>　　1前言1</b></p><p>　　1.1浮游病毒的研究現(xiàn)狀1</p><p>　　1.2本課題的研究目的和意義2</p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p><b>　　

10、2.1 試劑3</b></p><p>　　2.2 儀器與用品4</p><p>　　2.2.1 儀器4</p><p>　　2.2.2 其他用品4</p><p>　　2.3 樣品來(lái)源與處理4</p><p>　　2.3.1 站位設(shè)置4</p><p>　　2.3.2

11、樣品采集的準(zhǔn)備5</p><p>　　2.3.3 樣品的采集5</p><p>　　2.3.4 溫度、pH、DO值的測(cè)量6</p><p>　　2.3.5 樣品的處理6</p><p>　　2.4 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備7</p><p>　　2.4.1 耗材準(zhǔn)備7</p><p>　　2.4.2

12、 樣品稀釋7</p><p><b>　　2.5實(shí)驗(yàn)方法7</b></p><p>　　2.5.1 浮游病毒豐度的調(diào)查方法7</p><p>　　2.5.2 浮游病毒形態(tài)多樣性的調(diào)查方法9</p><p>　　2.6 照片計(jì)數(shù)以及樣品所含病毒顆粒的計(jì)算10</p><p>　　3 結(jié)果與

13、分析10</p><p>　　3.1 浮游病毒豐度調(diào)查結(jié)果與分析10</p><p>　　3.1.1總體分布10</p><p>　　3.1.2不同站點(diǎn)的浮游病毒豐度的檢測(cè)結(jié)果12</p><p>　　3.1.3 不同染色法的浮游病毒豐度的檢測(cè)結(jié)果14</p><p>　　3.1.4 四個(gè)站點(diǎn)水體環(huán)境因子的測(cè)

14、定結(jié)果14</p><p>　　3.1.5 不同季節(jié)各個(gè)站點(diǎn)浮游病毒數(shù)量的分布情況15</p><p>　　3.2 浮游病毒形態(tài)調(diào)查的結(jié)果與分析16</p><p>　　3.2.1 制樣方法對(duì)觀察效果的影響16</p><p>　　3.2.2 浮游病毒的種類、形態(tài)及精細(xì)結(jié)構(gòu)16</p><p>　　3.2.3

15、 浮游病毒的計(jì)數(shù)分析17</p><p><b>　　4 討論17</b></p><p>　　4.1 調(diào)查期間各站點(diǎn)水體中浮游病毒的數(shù)量分布17</p><p>　　4.1.1調(diào)查站點(diǎn)浮游病毒的水平分布特征17</p><p>　　4.1.2 調(diào)查水域浮游病毒數(shù)量與其他海區(qū)的比較18</p>&

16、lt;p>　　4.1.3 Sub-Green I和DAPI兩種熒光染色計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果比較分析18</p><p>　　4.1.4浮游病毒數(shù)量與水體環(huán)境因子的相關(guān)性19</p><p>　　4.1.5 調(diào)查期間不同季節(jié)各站點(diǎn)水體中浮游病毒數(shù)量的比較19</p><p>　　4.2 調(diào)查期間各站點(diǎn)水體中浮游病毒的多樣性19</p><

17、p><b>　　參考文獻(xiàn)21</b></p><p><b>　　致 謝23</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　1.1浮游病毒的研究現(xiàn)狀</p><p>　　浮游病毒(Virioplankton)存在于水體中的病毒，即水生態(tài)系

18、統(tǒng)中的病毒，指懸浮于水體中的包括噬菌體(bacteriophages)、噬藻體(cyanophages)、真核藻類病毒、浮游動(dòng)物病毒、人類病毒等在內(nèi)的各種群病毒。</p><p>　　浮游病毒形態(tài)有球形、紡錘形、檸檬形、長(zhǎng)尾蝌蚪、短尾蝌蚪等多形性[2-5]。它們分別約占總數(shù)的50%、18%及19%[1]。其豐度范圍從貧營(yíng)養(yǎng)水體的104VLPs/mL(病毒類粒子)到富營(yíng)養(yǎng)水體的108VLPs/mL，能夠引起大量的浮

19、游細(xì)菌和浮游植物的死亡[7][8-17]。病毒數(shù)量巨大，且具有重要的生態(tài)功能，它可以有效地控制宿主種群的大小，改變種群的遺傳結(jié)構(gòu)，甚至影響整個(gè)生物圈的物質(zhì)循環(huán)[18-22]。病毒個(gè)體雖然很微小，但在水體中含量卻如此巨大，可見(jiàn)其對(duì)水環(huán)境乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的影響是不容忽視的。因此近年來(lái)浮游病毒已成為生態(tài)學(xué)研究中的新熱點(diǎn)。</p><p>　　近幾十年來(lái)，隨著人類對(duì)海洋及內(nèi)河等的不斷認(rèn)識(shí)和探索，對(duì)占全球面積71%的海洋和

20、內(nèi)河研究愈來(lái)愈深入，同時(shí)對(duì)浮游病毒的研究日益加強(qiáng)，微生物學(xué)研究明顯加強(qiáng)。我國(guó)對(duì)海洋及內(nèi)河浮游病毒的數(shù)量分布和多樣性研究，如劉艷鳴等人運(yùn)用透射電鏡及熒光顯微技術(shù),對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化的武漢東湖中浮游病毒豐度及多樣性進(jìn)行了研究[6]。對(duì)浮游病毒的研究方法在這個(gè)過(guò)程中也不斷的多樣化和現(xiàn)代化。</p><p>　　浮游病毒的計(jì)數(shù)方法有空斑法、MPN法、透射電鏡法[23]、熒光顯微鏡法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)和標(biāo)記示蹤法等[7]。新發(fā)展

21、的浮游病毒計(jì)數(shù)方法有熒光法 (EFM)、 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法 (FCM)。熒光法通常都需要濃縮、酶解游離核酸、染色、固定、鏡檢等一系列步驟,而常見(jiàn)的熒光染料有DAPI、Yo-pro-1、Sub-Green I等。Sub-Green I的主要優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：安全性；超高的靈敏度；通用性；簡(jiǎn)便易用；與常規(guī)儀器兼容等，但是Sub-Green I熒光染料在擁有如此多的優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，也必定會(huì)有其不足之處，通用性高意味著專一性低，所以會(huì)對(duì)定量結(jié)果產(chǎn)生干擾，同

22、時(shí)也降低了反應(yīng)的專一性和可重復(fù)性，而且其褪色較快，但是由于其染色時(shí)間較短，亮度較高，而且不受乙醛固定劑的影響，因此，Sub-Green I被認(rèn)為是目前用于熒光計(jì)數(shù)浮游病毒的最佳染料。由于該領(lǐng)域多為新技術(shù)，在某些情況下用不同方法得到的結(jié)果往往相差較大，隨著研究方法的不斷深入，測(cè)量的靈敏度和準(zhǔn)確度會(huì)不斷提高[7]。電鏡法：電鏡技術(shù)已廣泛用于病毒的形態(tài)特征、分子結(jié)構(gòu)以及與宿主細(xì)胞相互作用的研究電鏡觀察可為病毒的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及分類定位提供最直

23、觀</p><p>　　浮游病毒，目前被普遍認(rèn)為是水體微生物群落豐度最高的活性成分，比細(xì)菌豐度高，它可通過(guò)裂解水生微生物群落中的優(yōu)勢(shì)種群來(lái)調(diào)節(jié)水體中微生物的物種多樣性、生物產(chǎn)量；影響碳和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流動(dòng)，進(jìn)而影響生物地化循環(huán)，介導(dǎo)生態(tài)系統(tǒng)中微生物之間的基因轉(zhuǎn)換，對(duì)水環(huán)境乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)都具有重要影響，另外，浮游病毒還可以通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和溶源轉(zhuǎn)換的方式介導(dǎo)水生態(tài)系統(tǒng)中微生物之間的基因轉(zhuǎn)換，在遺傳水平上影響水生微生物群

24、落的種群多樣性。但是浮游病毒取樣和分析方法比較復(fù)雜，野外分析比較困難，因此與浮游植物和浮游動(dòng)物相比，有關(guān)海域的歷史資料非常缺乏，對(duì)浮游病毒各種指標(biāo)的研究還是一個(gè)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。</p><p>　　1.2本課題的研究目的和意義</p><p>　　本論文主要是通過(guò)對(duì)浮游病毒的數(shù)量分布的研究，根據(jù)站點(diǎn)的不同，研究?jī)?nèi)河中浮游病毒在水平方向的變化，以及水體環(huán)境因子對(duì)病毒豐度的影響，來(lái)探討寧波高

25、教園區(qū)人類活動(dòng)對(duì)水體的污染狀況和生態(tài)效應(yīng)，以便為內(nèi)河污染防治和生態(tài)環(huán)境保護(hù)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為人類活動(dòng)的正確性和適度性提供科學(xué)的依據(jù)。</p><p>　　從水樣中分離濃縮病毒，不僅過(guò)程繁雜、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高。還會(huì)使水樣中病毒的數(shù)量及完整性受損，可免去分離濃縮程序，直接對(duì)水樣中的浮游病毒進(jìn)行制樣和電鏡觀察。因此，本論文也對(duì)海水樣中浮游病毒樣品的不同制備方法及電鏡觀察效果進(jìn)行比較。</p><p>

26、;　　目前正面臨水體富營(yíng)養(yǎng)化、全球變暖等狀況，生物可利用的碳、氮循環(huán)有相當(dāng)重要的部分是來(lái)自海洋食物網(wǎng)。只有測(cè)定浮游生物生理和生態(tài)效應(yīng)，對(duì)全球碳、氮循環(huán)的影響，才可能使大規(guī)模人為造成的碳、氮釋放及失衡狀況得到預(yù)測(cè)和改善。毫無(wú)疑問(wèn)，浮游病毒的研究具有著重要理論意義和實(shí)用性。水體中浮游病毒數(shù)量巨大，種類極多，因而對(duì)水體浮游病毒的研究將有巨大的發(fā)展空間。在國(guó)際上對(duì)水體浮游病毒的研究在八十年代后方開(kāi)始興起，而我國(guó)在該領(lǐng)域的研究才剛剛起步。調(diào)查水體

27、中浮游病毒的時(shí)空變化以及分析浮游病毒與水體環(huán)境因子之間的關(guān)系有利于明確浮游病毒在水體生態(tài)系統(tǒng)中的位置和作用。近年來(lái)，浮游病毒多樣性研究及其在水體生態(tài)系統(tǒng)匯總的作用越來(lái)越受到科學(xué)家的重視，但是目前仍然有許多類型的浮游病毒尚未被我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)浮游病毒缺乏系統(tǒng)的了解。我國(guó)水體環(huán)境質(zhì)量的退化，污染范圍的擴(kuò)大，生物資源逐漸衰退，因此在利用水體的同時(shí)對(duì)水體環(huán)境進(jìn)行正常性的檢測(cè)和保護(hù)水體環(huán)境非常重要。</p><p><b

28、>　　2 材料與方法 </b></p><p><b>　　2.1 試劑</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所需試劑情況如表1 所示。</p><p>　　表1 實(shí)驗(yàn)所需試劑</p><p>　　注：GR：優(yōu)級(jí)純。主成份含量很高、純度很高，適用于精確分析和研究工作，有的可作為基準(zhǔn)物質(zhì)。AR：分析純。主

29、成份含量很高、純度較高，干擾雜質(zhì)很低，適用于工業(yè)分析及化學(xué)實(shí)驗(yàn)。LR：實(shí)驗(yàn)純。主成份含量高、純度較差，雜質(zhì)含量不做選擇，只適用于一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。BR：生化試劑。用于配制生物化學(xué)檢驗(yàn)試液，和生化合成。BS：生物染色劑。適用于配制生物標(biāo)本染色液。</p><p><b>　　2.2儀器與用品</b></p><p><b>　　2.2.1儀器</b

30、></p><p>　　超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；BCD-281KA海爾電冰箱（青島海爾集團(tuán)有限公司）；13SA系列電子天平（德國(guó)塞多利斯股份有限公司）；pH計(jì)（德國(guó)塞多利斯股份有限公司）；YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；Olympus BX51熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Millipore的抽濾三連體；HACH的Multiparameter Meters（Se

31、nsion156）；三洋SANYO干燥箱（上海西域機(jī)電系統(tǒng)有限公司）；Thermo Scientific Revco ULT 超低溫冰箱（濟(jì)南西美貿(mào)易公司）；超速離心機(jī)（日立）；透射電鏡（JEM）等。</p><p><b>　　2.2.2其他用品</b></p><p>　　移液槍、濾膜（0.22μm Millipore Nitrocellulo

32、se, 0.02μm Whatman）、福爾膜、碳膜、指甲油、玻片、干凈載玻片和蓋玻片、槍頭、錫箔紙、銅網(wǎng)、絲口瓶、離心管、培養(yǎng)皿、75%酒精棉花、鑷子、酒精燈、超濾水、注射器（1mL、5mL）、濾頭（0.22μm、0.1μm）、裝有冰塊的泡沫盒、標(biāo)簽紙、量筒、燒杯、報(bào)紙、放制好的玻片的盒子、橡皮筋等。</p><p>　　2.3樣品來(lái)源與處理</p><p><b>　　2.3

33、.1站位設(shè)置</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)于2010年1月，在寧波高教園區(qū)附近內(nèi)河采集樣品， 對(duì)其進(jìn)行浮游病毒豐度和形態(tài)的調(diào)查。</p><p><b>　　圖1 站位地圖</b></p><p><b>　　圖2 采樣站點(diǎn)設(shè)置</b></p><p>　　注:2-A,高教園區(qū)站點(diǎn)

34、;2-B,萬(wàn)里學(xué)院站點(diǎn);2-C,鄞州體育館站點(diǎn);2-D,鄞州公園站點(diǎn)</p><p>　　2.3.2樣品采集的準(zhǔn)備</p><p>　　準(zhǔn)備28根50mL的離心管，將其經(jīng)過(guò)自來(lái)水和蒸餾水的反復(fù)沖洗干凈后用報(bào)紙包好，置于滅菌鍋中121℃ 20min高壓滅菌，滅菌結(jié)束后置于干燥箱干燥，待其完全干燥后，取出，分別貼好標(biāo)簽并用橡皮筋捆綁好放入冰盒中待用。帶上測(cè)HACH的Multiparameter

35、 Meters（Sension156）同時(shí)測(cè)定溫度、pH、DO值。</p><p>　　2.3.3樣品的采集</p><p>　　利用滅菌過(guò)的離心管采集4個(gè)站點(diǎn)的水樣。樣品采集后置于滅菌的離心管中，每個(gè)站點(diǎn)的3根離心管采集離水面1cm左右的水樣，另3根裝離心管裝離水面10cm左右的水樣，向前3根離心管內(nèi)立即加入經(jīng)過(guò)0.22µm濾頭的甲醛，使樣品終濃度約為5%，后3根離心管內(nèi)立即加

36、入經(jīng)過(guò)0.22µm濾頭的戊二醛，使樣品終濃度為2.5%，分別混勻。高教園區(qū)公園內(nèi)河流（靠近理工學(xué)院）的6個(gè)水樣，分別命名為L(zhǎng)G1、LG2、LG3、LG4、LG5、LG6，鄞州體育館內(nèi)河流的6個(gè)水樣，分別命名為T(mén)YG1、TYG2、TYG3、TYG4、TYG5、TYG6，鄞州公園內(nèi)河流的6個(gè)水樣，分別命名為YZGY1、YZGY2、YZGY3 、YZGY4、YZGY5、YZGY6，萬(wàn)里學(xué)院內(nèi)河流的6個(gè)水樣，分別命名為WL1、WL2、

37、WL3、WL4、WL5、WL6。</p><p>　　2.3.4溫度、pH、DO值的測(cè)量</p><p>　　將各自的探頭和儀器連接好，將探頭放入水面測(cè)量pH時(shí)按儀器上pH鍵后按read鍵自動(dòng)測(cè)量，直到儀器發(fā)出叫聲，顯示屏幕上出現(xiàn)小鎖的標(biāo)記時(shí)即可讀下數(shù)據(jù)，并記錄。各探頭在使用后要用蒸餾水洗凈并用紙巾擦干待用。</p><p><b>　　圖3 采樣過(guò)程&l

38、t;/b></p><p>　　注:3-A,高教園區(qū)站點(diǎn);3-B,萬(wàn)里學(xué)院站點(diǎn);3-C,鄞州體育館站點(diǎn);3-D,鄞州公園站點(diǎn).</p><p>　　2.3.5樣品的處理</p><p>　　所有樣品采集后置冰盒中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)上，將各個(gè)站點(diǎn)分別用甲醛和戊二醛固定的水樣倒入分別事先準(zhǔn)備好的8個(gè)燒杯內(nèi)，混勻后再重新分裝，用橡皮筋捆綁好各個(gè)站點(diǎn)的樣品，

39、甲醛固定的樣品置于－86℃超低溫保存，用于浮游病毒總數(shù)的測(cè)定；戊二醛固定的樣品置于4℃冰箱內(nèi)保存，1周內(nèi)進(jìn)行浮游病毒形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)。</p><p><b>　　2.4實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備</b></p><p><b>　　2.4.1耗材準(zhǔn)備</b></p><p>　　玻片的制備：將蓋玻片和載玻片浸泡于濃硫酸中1～2天后再用自來(lái)水浸

40、泡至中性，接著將玻片一片一片的用自來(lái)水和蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次，沖洗干凈后置于酒精中充分浸泡。在超凈工作臺(tái)上，取出玻片在酒精燈前烘干，置于干凈的盒子中待用。</p><p>　　超濾水的制備：將約1000mL的蒸餾水進(jìn)行高壓滅菌，待其冷卻后進(jìn)行抽濾。將高壓滅菌水加滿濾筒并抽濾2~3次對(duì)濾器進(jìn)行清洗。卸下濾筒，在濾板上放置孔徑為0.22μm的微孔濾膜作襯底，后將孔徑為0.02μm的氧化鋁濾膜放于襯墊上，裝配好濾筒，接著

41、將滅菌水進(jìn)行抽濾，絲口瓶用抽濾水洗滌后再裝入抽濾水。待抽濾工作結(jié)束后，將所有抽濾水進(jìn)行高壓滅菌，待其冷卻后置于無(wú)菌室待用。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)中將使用的所有耗材進(jìn)行高壓滅菌干燥后置于無(wú)菌室待用。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先將水樣和染色劑從冰箱里拿出置于常溫下凍融，染色劑的凍融要在避光的條件下。接著將超凈工作臺(tái)用酒精棉擦拭干凈后放上實(shí)驗(yàn)耗材，進(jìn)行紫外照射并通風(fēng)15min。</p><p><b

42、>　　2.4.2樣品稀釋</b></p><p>　　進(jìn)入無(wú)菌室前穿好白大褂，進(jìn)入后用酒精棉全面擦拭手，將工作臺(tái)上的實(shí)驗(yàn)耗材整理好，水樣放在冰上，點(diǎn)燃酒精燈，開(kāi)始稀釋用甲醛固定的樣品（戊二醛固定的樣品不需要稀釋），用量筒量取45mL超濾水倒入離心管中，然后用移液槍移取5mL樣品打入離心管，慢慢吹打數(shù)次使其混勻，將樣品稀釋到10-1，換掉槍頭，從10-1稀釋樣中移取5mL樣品打入另一支裝有45mL

43、超濾水的離心管中，慢慢吹打數(shù)次使其混勻，即為稀釋樣10-2。重復(fù)上述操作一直稀釋至10-4，且每次吸取前都需搖蕩混勻樣品，稀釋完成的樣品都需置于冰上待用，所有操作都需靠近酒精燈，避免污染。</p><p>　　重復(fù)上述步驟稀釋剩余的樣品，并貼上標(biāo)簽置冰盒內(nèi)待下一步操作。</p><p><b>　　2.5實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2

44、.5.1浮游病毒豐度的調(diào)查方法</p><p>　　2.5.1.1 DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法</p><p>　　配制DAPI染色劑：在避光條件下，將DAPI原液稀釋至5μg/mL，置于冰浴避光處保存待用。</p><p>　　濾器裝備：清洗抽濾三聯(lián)體后，在濾板上按順序放上0.22μm和0.02μm微孔濾膜，裝配好濾筒。</p><p>　　加

45、樣抽濾：用注射器吸取5mL樣品，趕凈注射器內(nèi)的氣泡，將樣品通過(guò)0.45μm濾頭打入濾筒內(nèi)，打開(kāi)真空泵抽濾至干，真空泵的壓力控制在負(fù)壓（15～20kPa）。 </p><p>　　濾杯使用后經(jīng)過(guò)滅菌或用經(jīng)0.02μm過(guò)濾的高壓滅菌蒸餾水加滿濾杯并抽濾2~3次對(duì)濾器進(jìn)行清洗（當(dāng)天使用的濾器，在各個(gè)樣品測(cè)定前用同樣方法清洗一次）。卸下濾杯，放上孔徑為0.02μm的氧化鋁濾膜，裝配好濾杯。 染色：在弱光條件下，先

46、用1mL注射器吸取一定量?jī)鋈诘腄API染液（5μg/mL），打入0.01μm濾頭到剛開(kāi)始有染液從濾頭中滴出時(shí)為止，再重新吸取1mL的染液滴入到濾杯內(nèi)的膜中間，擋光靜止染色8min后抽濾。</p><p>　　在染色的同時(shí)，槍頭盒在使用前用酒精棉再擦拭一遍，待干后放上載玻片，將用濃硫酸、酒精、蒸餾水處理過(guò)的載玻片取出，用超凈工作臺(tái)吹出來(lái)的風(fēng)吹干后放于已滅菌的槍頭盒上。同樣把蓋玻片也取出干后放于載玻片的一角，但不全部

47、接觸方便蓋蓋玻片時(shí)方便拿取。</p><p>　　制片：濾干后卸下濾筒用專用鑷子小心取下載有染色樣品的氧化鋁膜，放于干凈的載玻片上展平，滴上1滴無(wú)熒光的鏡油，蓋上蓋玻片，若有氣泡需排除氣泡，用指甲油密封蓋玻片四周，貼上標(biāo)簽，待指甲油干后放于已用酒精棉擦拭晾干的玻片盒中避光保存待觀察。</p><p>　　2.5.1.2 Sub-Green I熒光染色計(jì)數(shù)法</p><p

48、>　　配制染色劑：取出Sub-Green I儲(chǔ)備液，用經(jīng)0.02μm過(guò)濾的無(wú)菌去離子水按1:10稀釋，操作必須在弱光環(huán)境中進(jìn)行，再用0.02μm過(guò)濾的無(wú)菌去離子水配成0.25%的染色劑，分裝好再與未用完的儲(chǔ)備液應(yīng)立即放回－20℃冰箱避光保存。 配制熒光保護(hù)劑工作液：臨用前取10% p-苯二胺儲(chǔ)備液,化霜搖勻后，吸取10μL與990μLPBS甘油儲(chǔ)備液混合，制成工作液，該工作液應(yīng)避光、置于冰浴，未用完的10% p-苯二胺儲(chǔ)備

49、液應(yīng)立即進(jìn)行冷凍，但該儲(chǔ)備液管累計(jì)凍融3次后，便需丟棄。如果10%p-苯二胺儲(chǔ)備液或熒光保護(hù)劑溶液呈現(xiàn)棕色，則應(yīng)重新配制。</p><p>　　加樣抽濾：用注射器吸取5mL樣品，趕凈注射器內(nèi)的氣泡，將樣品通過(guò)0.45μm濾頭打入濾筒內(nèi)，在負(fù)壓（15~20kPa）條件下，將樣品抽濾至干，卸下濾杯。 染色：吸取97.5μL超濾水滴入滅菌的培養(yǎng)皿中，再向該水滴中加入2.5μl Sub-Green I染色劑工作液

50、，培養(yǎng)皿和染色劑需置于冰浴避光處。用專用鑷子小心取下載有樣品的氧化鋁膜，將膜的非載樣面放在培養(yǎng)皿的染色液滴上，冰浴避光染色15min。</p><p>　　制片：染色后，取出濾膜，吸干貼在濾膜背面及邊緣上的濾滴，將濾膜緊貼于載玻片上，并在載樣面上加30μL熒光保護(hù)劑工作液，蓋上蓋玻片，若有氣泡需排除氣泡，用指甲油密封蓋玻片四周，貼上標(biāo)簽，待指甲油干后放在包有錫箔紙且消毒的盒子中，置于冰箱中保存待觀察。</p

51、><p>　　2.5.1.3熒光顯微鏡觀察</p><p>　?。?）將熒光顯微鏡觀察室環(huán)境打造成無(wú)光，汞燈先開(kāi)10~15min。時(shí)間到后打開(kāi)電源、電腦、顯微鏡電源開(kāi)關(guān)、熒光開(kāi)關(guān)等弧光到穩(wěn)定狀態(tài)將樣品放到載物臺(tái)。</p><p>　?。?）通過(guò)調(diào)節(jié)視物光闌、孔徑光闌到“0”，調(diào)整整個(gè)視野亮度均勻一致、亮度最大，開(kāi)始觀察。</p><p>　　（3

52、）打開(kāi)shutter鍵，從最低倍鏡下開(kāi)始觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋至目鏡中出現(xiàn)點(diǎn)，由于顯微鏡直接連接到電腦上，我們可以根據(jù)打開(kāi)的屏幕上的程序直接觀察，看到亮點(diǎn)后再調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至清晰后轉(zhuǎn)至下一倍物鏡。</p><p>　　（4）到100倍鏡時(shí)，先將物鏡轉(zhuǎn)成八字，在片上滴上一滴Olympus的鏡油后再?gòu)?00倍鏡下通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋觀察，在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光道油鏡條件下，DAPI染色的病毒呈亮藍(lán)色，Sub-Green

53、I染色的病毒呈亮綠色。</p><p>　?。?）拍照：看到清晰點(diǎn)后，調(diào)節(jié)刻度尺放入拍照界面并拍下照片，拍照時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)載物臺(tái)多拍幾張，最后數(shù)據(jù)可求平均值保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。</p><p>　?。?）觀察結(jié)束后，講物鏡轉(zhuǎn)成八字拿出玻片，將玻片和鏡頭上的鏡油擦干凈，避光保存好再拿出另外制好的片子同上述步驟進(jìn)行觀察。</p><p>　　2.5.2浮游病毒形態(tài)多樣性的調(diào)查

54、方法</p><p><b>　　2.5.2.1制樣</b></p><p>　　方法之一：水樣直接滴到銅網(wǎng)上，采用常規(guī)的滴染法，即把水樣直接滴在覆有Formvar（福爾）膜和碳支持膜的銅網(wǎng)上，使形成一小液珠，放置片刻，用濾紙條吸去多余的液體，自然干燥。</p><p>　　方法之二：水樣經(jīng)超速離心到銅網(wǎng)上，參照劉艷鳴等的方法[6]。以2500

55、0r/min離心3h，使病毒沉淀到銅網(wǎng)上，棄去上清，空氣干燥。</p><p><b>　　2.5.2.2染色</b></p><p>　　醋酸雙氧鈾染色：在蠟盤(pán)中滴加2%的醋酸雙氧鈾，然后將上述干燥好的銅網(wǎng)漂浮在染液上，染色2~3min。</p><p>　　磷鎢酸染色：將2%的磷鎢酸滴加到蠟盤(pán)中將上述干燥好的銅網(wǎng)插入其中，染色2~3min。

56、</p><p>　　2.5.2.3電鏡觀察</p><p>　　在JEM-1011型透射電鏡下觀察，加速電壓為100kv利用GATAN INC CCD圖像傳輸系統(tǒng)，獲得電鏡圖片。</p><p>　　2.6照片計(jì)數(shù)以及樣品所含病毒顆粒的計(jì)算</p><p>　　根據(jù)照片上的刻度對(duì)病毒的染色顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值再計(jì)算樣品中所含病毒顆粒。計(jì)

57、算式為：VN = Na ·S / [Sf · ( 1 - 0.05 ) · V] 式中：VN----樣品含病毒數(shù)，單位為個(gè)每升（VLPs /L）Na-----各視野平均病毒數(shù)，單位為個(gè)（particles）S-------濾膜實(shí)際過(guò)濾面積，單位為平方毫米（mm2）Sf------顯微鏡視野面積，單位為平方毫米（mm2）V-------過(guò)濾樣品量，單位為升（L）（注：式中 0.05 為加入 3

58、7%~40%甲醛占固定樣品總體積的比例）</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1浮游病毒豐度調(diào)查結(jié)果與分析</p><p><b>　　3.1.1總體分布</b></p><p>　　調(diào)查期間，寧波高教園區(qū)四條內(nèi)河的浮游病毒總體分布如表2。</p>

59、<p>　　表2 調(diào)查期間寧波高教園區(qū)內(nèi)河浮游病毒豐度</p><p>　　注:浮游病毒豐度單位為×105個(gè)/mL(均值).下同.</p><p>　　由表2可知，在調(diào)查期間，鄞州體育館站點(diǎn)浮游病毒豐度實(shí)測(cè)平均值變化范圍為11.2×105~11.5×105個(gè)/mL；萬(wàn)里學(xué)院站點(diǎn)浮游病毒豐度實(shí)測(cè)平均值變化范圍為8.02×105~8.46

60、×105個(gè)/mL；鄞州區(qū)高教園區(qū)公園站點(diǎn)浮游病毒豐度實(shí)測(cè)平均值變化范圍為7.91×105~8.47×105個(gè)/mL；鄞州公園站點(diǎn)浮游病毒豐度實(shí)測(cè)平均值變化范圍為5.72×105~6.92×105個(gè)/mL； </p><p>　　圖4 DAPI熒光染色計(jì)數(shù)圖</p><p>　　注:4-A,高教園區(qū)站點(diǎn);4-B,萬(wàn)里學(xué)院站點(diǎn);4-C,鄞州體

61、育館站點(diǎn);4-D,鄞州公園站點(diǎn)</p><p>　　圖5 Sub-Green熒光染色計(jì)數(shù)圖</p><p>　　注:5-A,高教園區(qū)站點(diǎn);5-B,萬(wàn)里學(xué)院站點(diǎn);5-C,鄞州體育館站點(diǎn);5-D,鄞州公園站點(diǎn)</p><p>　　3.1.2不同站點(diǎn)的浮游病毒豐度的檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　圖6 調(diào)查期間不同站點(diǎn)的浮游病毒總數(shù)（DAPI）<

62、;/p><p>　　由圖6可知，運(yùn)用DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法，浮游病毒在鄞州體育館站點(diǎn)的分布數(shù)量明顯高于其他站點(diǎn)，達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí)，平均值為11.5×105個(gè)/mL；萬(wàn)里學(xué)院和高教園區(qū)公園站點(diǎn)的浮游病毒分布數(shù)量略低，但差異不大，平均值分別為8.02×105個(gè)/mL和7.91×10個(gè)/mL；鄞州公園內(nèi)河的病毒分布數(shù)量明顯低于其他站點(diǎn)，平均值為5.72×105個(gè)/mL。</p&g

63、t;<p>　　圖7 調(diào)查期間不同站點(diǎn)的浮游病毒總數(shù)（Sub-Green I）</p><p>　　由圖7可知，運(yùn)用Sub-Green I熒光染色計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果與DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果一致，浮游病毒在鄞州體育館站點(diǎn)的分布數(shù)量最高，平均值為11.2×105個(gè)/mL；而在鄞州公園站點(diǎn)最低，平均值為6.92×105個(gè)/mL；萬(wàn)里學(xué)院與高教園區(qū)公園站點(diǎn)居中，兩者數(shù)量差異不大，

64、平均值分別為8.46×105個(gè)/mL和8.47×105個(gè)/mL。</p><p>　　3.1.3不同染色法的浮游病毒豐度的檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　圖8 調(diào)查期間不同站點(diǎn)的浮游病毒總數(shù)</p><p>　　由圖8可知，運(yùn)用Sub-Green I熒光染色計(jì)數(shù)法與DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法對(duì)同一站點(diǎn)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果差異不大?？傮w上，

65、Sub-Green I熒光染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)出的浮游病毒在四個(gè)站點(diǎn)的分布數(shù)量略高于DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)的。</p><p>　　3.1.4四個(gè)站點(diǎn)水體環(huán)境因子的測(cè)定結(jié)果</p><p>　　圖9 調(diào)查期間不同站點(diǎn)的環(huán)境因子的測(cè)定結(jié)果</p><p>　　由圖9可知，調(diào)查期間寧波高教園區(qū)四個(gè)站點(diǎn)溫度（ST）的實(shí)測(cè)平均值變化范圍為6.7~10.5℃，鄞州體育館站點(diǎn)的溫

66、度明顯高于其他站點(diǎn)，萬(wàn)里學(xué)院和高教園區(qū)公園站點(diǎn)的溫度略低，鄞州公園站點(diǎn)的溫度最低；總體上來(lái)看，鄞州區(qū)四個(gè)站點(diǎn)的pH值差異不大，實(shí)測(cè)平均值變化范圍為8.5~8.8；調(diào)查期間鄞州區(qū)四個(gè)站點(diǎn)溶氧（DO）的實(shí)測(cè)平均值變化范圍為5.5~9.26 mg/L，從總體變化來(lái)看，高教園區(qū)公園站點(diǎn)的溶氧最高，鄞州公園站點(diǎn)的溶氧明顯低于其他站點(diǎn)。</p><p>　　3.1.5不同季節(jié)各個(gè)站點(diǎn)浮游病毒數(shù)量的分布情況</p>

67、<p>　　圖10 調(diào)查期間不同季節(jié)浮游病毒數(shù)量的比較（DAPI）</p><p>　　圖11調(diào)查期間不同季節(jié)浮游病毒數(shù)量的比較（Sub-Green I）</p><p>　　由圖10和圖11可知，運(yùn)用Sub-Green I熒光染色計(jì)數(shù)法與DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法對(duì)不同季節(jié)同一站點(diǎn)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，調(diào)查期間春季寧波高教園區(qū)內(nèi)河各個(gè)站點(diǎn)浮游病毒的數(shù)量明顯高于冬季浮游病毒的

68、數(shù)量。</p><p>　　3.2浮游病毒形態(tài)調(diào)查的結(jié)果與分析</p><p>　　3.2.1制樣方法對(duì)觀察效果的影響</p><p>　　我們分別采用了兩種制樣方法和兩種染色方法，結(jié)果顯示：不同的制樣和染色方法對(duì)電鏡觀察效果有明顯的影響。</p><p>　　利用方法一所制備的樣品，無(wú)論經(jīng)醋酸雙氧鈾染色，還是磷鎢酸染色，都存在雜質(zhì)多，背景暗

69、，而病毒顆粒少的情況，甚至許多視野看不到病毒顆粒?？梢?jiàn)，該方法不適宜制備浮游病毒的樣品。</p><p>　　利用方法二所制備的樣品，經(jīng)磷鎢酸染色后，整個(gè)圖像背景雜亂，病毒顆粒分布不均勻，形態(tài)模糊，該方法也無(wú)法對(duì)水樣中的浮游病毒進(jìn)行準(zhǔn)確觀察。</p><p>　　同樣利用方法二所制備的樣品，經(jīng)醋酸雙氧鈾染色后，可觀察到大量形態(tài)和數(shù)量不同的病毒顆粒。因此該方法可有效用于浮游病毒的形態(tài)觀察及計(jì)

70、數(shù)分析，下述電鏡圖片均是通過(guò)該方法得到的。</p><p>　　圖12 水樣中浮游病毒的電鏡照片</p><p>　　注:12-A,球形病毒顆粒;12-B,桿狀病毒(箭頭所指)和許多蝌蚪狀病毒顆粒;12-C,長(zhǎng)尾蝌蚪狀病毒顆粒;12-D,不同蝌蚪狀病毒顆粒(箭頭所指).A,C,D中標(biāo)尺為:200 nm ;B中標(biāo)尺為500 nm.</p><p>　　3.2.2浮游病

71、毒的種類、形態(tài)及精細(xì)結(jié)構(gòu)</p><p>　　用方法二所制備的浮游病毒樣品，在透射電鏡下，不僅可清晰地觀察到病毒顆粒的形態(tài)，如球形、桿狀和蝌蚪狀等(圖11)還能了解其部分精細(xì)結(jié)構(gòu)，包括球形病毒的子粒、桿狀病毒的核衣殼(橫紋狀結(jié)構(gòu))和蝌蚪狀病毒的尾髓等，如下圖。</p><p>　　圖13 浮游病毒的精細(xì)結(jié)構(gòu)</p><p>　　注: 13-A,球形病毒的子粒; 13

72、-B,桿狀病毒的核衣殼; 13-C,具有不同尾部結(jié)構(gòu)的蝌蚪樣病毒顆粒(箭頭所指) ; A中標(biāo)尺為50 nm; B,C中標(biāo)尺為200 nm.</p><p>　　3.2.3浮游病毒的計(jì)數(shù)分析</p><p>　　在進(jìn)行樣品觀察時(shí)，可以根據(jù)需要來(lái)調(diào)節(jié)電鏡的放大倍數(shù)。如要了解病毒的精細(xì)結(jié)構(gòu)時(shí)，可將放大倍數(shù)調(diào)節(jié)到8~10萬(wàn)倍；如要對(duì)水樣中的浮游病毒進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，就將放大倍數(shù)調(diào)低至2萬(wàn)倍左右，在此條

73、件下，視野較寬，病毒的形態(tài)及數(shù)量都清晰觀察到(見(jiàn)圖10-B)。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　4.1調(diào)查期間各站點(diǎn)水體中浮游病毒的數(shù)量分布</p><p>　　有關(guān)寧波高教園區(qū)附近河流中浮游病毒的報(bào)道很少，因此對(duì)該區(qū)河流的浮游病毒進(jìn)行了調(diào)查，以期了解近岸人類活動(dòng)及其他因素對(duì)該區(qū)河水質(zhì)量的影響。</p&g

74、t;<p>　　4.1.1調(diào)查站點(diǎn)浮游病毒的水平分布特征</p><p>　　運(yùn)用Sub-Green I熒光染色計(jì)數(shù)法與DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法對(duì)寧波高教園區(qū)附近四條站點(diǎn)的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)均可分離得到浮游病毒，數(shù)量級(jí)達(dá)到105個(gè)/mL。鄞州體育館站點(diǎn)浮游病毒豐度實(shí)測(cè)平均值變化范圍為11.2×105~11.5×105個(gè)/mL，明顯高于其他站點(diǎn)。萬(wàn)里學(xué)院和鄞州區(qū)高教園區(qū)公園站點(diǎn)浮游病毒豐度

75、略低，而鄞州公園站點(diǎn)浮游病毒豐度最低，為5.72×105~6.92×105個(gè)/mL。這種分布狀況可能與鄞州體育館內(nèi)及附近人類活動(dòng)強(qiáng)度較大有關(guān)，該站點(diǎn)兩岸分別是居民區(qū)和居民健身活動(dòng)區(qū)，如體育館內(nèi)游泳池的水會(huì)排入該河流，水體交換少，受居民生活污水和陸源雙重影響，且該站點(diǎn)有養(yǎng)殖較多的魚(yú)類，湖面浮有較多的藻類，水體呈明顯的深綠色，所以數(shù)值較高。而萬(wàn)里學(xué)院和高教園區(qū)站點(diǎn)相較體育館來(lái)說(shuō)，附近的人類活動(dòng)較少，四周綠化情況較好，受陸

76、源污染影響較小。鄞州公園屬于人類休閑娛樂(lè)的地方，一些有排放污染性尾氣的交通工具都禁止出入，最主要的是該河流水域開(kāi)闊，水流速度較大，水體的自凈能力較強(qiáng)，污染物的擴(kuò)散能力也較其他站點(diǎn)強(qiáng)，污染物濃度亦隨之逐漸降低，因此浮游病毒的數(shù)量相對(duì)比較低。</p><p>　　4.1.2調(diào)查水域浮游病毒數(shù)量與其他海區(qū)的比較</p><p>　　與已報(bào)導(dǎo)的內(nèi)河浮游病毒豐度的比較如表4所示：</p>

77、<p>　　表3 與已報(bào)道的內(nèi)河浮游病毒豐度比較 </p><p>　　由表4可知，國(guó)內(nèi)各地的內(nèi)河浮游病毒的豐度都在平均值數(shù)量級(jí)在105~108個(gè)/mL，而本實(shí)驗(yàn)所研究的寧波高教園區(qū)附近內(nèi)河中浮游病毒豐度的變化范圍為8.29×105~8.77×105個(gè)/mL，平均值為8.53×105個(gè)/mL，略低于其他內(nèi)河的病毒數(shù)，可能是由于調(diào)查站點(diǎn)并非大面積養(yǎng)殖水域，且不接近工業(yè)區(qū)，

78、而是屬于居民生活?yuàn)蕵?lè)區(qū)域，因而數(shù)值相對(duì)較低，由此推測(cè)寧波高教園區(qū)內(nèi)河水體有機(jī)物或重金屬的污染較輕微，居民的生活污水和娛樂(lè)休閑的廢棄物污染居多。</p><p>　　4.1.3 Sub-Green I和DAPI兩種熒光染色計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果比較分析</p><p>　　通過(guò)對(duì)Sub-Green I和DAPI兩種熒光染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果的比較分析，可知Sub-Green I熒光染色計(jì)數(shù)法觀察到的病

79、毒數(shù)量高于DAPI熒光染色計(jì)數(shù)法。DAPI 是最早用于對(duì)浮游病毒進(jìn)行研究的熒光染料，它能夠?qū)﹄p鏈 DNA 進(jìn)行特異性染色。Sub-Green I則是近年來(lái)才被應(yīng)用于浮游病毒的計(jì)數(shù)的,這種染料的優(yōu)勢(shì)在于具有較低的背景及高于 DAPI 熒光的穩(wěn)定性和亮度，Sub-Green I是雙鏈DNA染料，它們已替代 DAPI 成為主流的熒光染料。目前Sub-Green I被認(rèn)為是用于熒光計(jì)數(shù)浮游病毒的最佳染料。由于該領(lǐng)域多為新技術(shù)，在某些情況下用不同

80、方法得到的結(jié)果往往相差較大，隨著研究方法的不斷深入，測(cè)量的靈敏度和準(zhǔn)確度會(huì)不斷提高。</p><p>　　4.1.4浮游病毒數(shù)量與水體環(huán)境因子的相關(guān)性</p><p>　　水體中浮游病毒數(shù)量和分布情況取決于其宿主在水體中的分布狀況。浮游病毒的宿主主要為浮游細(xì)菌和浮游藻類。當(dāng)外界環(huán)境像水體中輸入大量營(yíng)養(yǎng)物且周?chē)h(huán)境有利于浮游病毒的宿主的生長(zhǎng)，便會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生大量的浮游病毒顆粒[13]。</

81、p><p>　　寧波高教園區(qū)附近內(nèi)河的浮游病毒豐度與環(huán)境因子相關(guān)性分析結(jié)果表明，溫度和溶氧是影響寧波高教園區(qū)附近內(nèi)河浮游病毒分布的主要因素。經(jīng)過(guò)春夏秋季到冬季，浮游病毒的數(shù)量也隨之變化，而在春秋兩個(gè)季節(jié)病毒數(shù)量會(huì)較高，適宜的水溫可以使浮游病毒的宿主大量的生長(zhǎng)繁殖，因而產(chǎn)生大量的病毒顆粒。在本次調(diào)查中，鄞州體育館站點(diǎn)的水溫明顯高于其他站點(diǎn)，是影響病毒數(shù)量的重要因素。pH對(duì)浮游病毒的分布影響不是很明顯，四個(gè)站點(diǎn)的pH值都

82、比較接近。浮游病毒的宿主大部分是好養(yǎng)菌，菌體的呼吸代謝和細(xì)胞內(nèi)的各種生化反應(yīng)都需要氧的參與，因此，水體中的溶解氧含量對(duì)浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生影響，進(jìn)而直接影響浮游病毒的生長(zhǎng)繁殖。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)寧波高教園區(qū)內(nèi)河浮游病毒的數(shù)量與溶氧量有一定的關(guān)系。</p><p>　　4.1.5調(diào)查期間不同季節(jié)各站點(diǎn)水體中浮游病毒數(shù)量的比較</p><p>　　通過(guò)Sub-Green I和DAPI兩種熒光染色計(jì)

83、數(shù)法對(duì)不同季節(jié)各個(gè)站點(diǎn)水體中浮游病毒的數(shù)量進(jìn)行了測(cè)定，從總體變化來(lái)看，春季水體中浮游病毒的數(shù)量明顯高于冬季水體中浮游病毒的數(shù)量。由于春季水體的環(huán)境因子，如水溫、溶氧、營(yíng)養(yǎng)鹽，都為浮游病毒的宿主提供了最適宜的生長(zhǎng)條件，所以大量的宿主生長(zhǎng)繁殖，便會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生大量的浮游病毒顆粒；而經(jīng)過(guò)浮游病毒顆粒產(chǎn)量高峰期的秋季，水體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都已被消耗殆盡，也產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，進(jìn)入冬季后，浮游病毒的宿主由于缺乏營(yíng)養(yǎng)物和能量的供給而不能生長(zhǎng)甚至死亡；此外

84、，冬季水體的環(huán)境因子都不利于浮游病毒宿主的存活，所以浮游病毒顆粒的數(shù)量就會(huì)減少。分析發(fā)現(xiàn)水體中浮游病毒數(shù)量的變化與季節(jié)的變化具有相關(guān)性。</p><p>　　4.2調(diào)查期間各站點(diǎn)水體中浮游病毒的多樣性</p><p>　　我們采用了不同的制樣和染色方法，對(duì)水體中的浮游病毒進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，常規(guī)的直接滴染法雖然簡(jiǎn)便快捷，但由于浮游病毒在水體中的含量與分離或純化后的樣品相比，其量相對(duì)較少且分

85、布不均勻，圖像背景雜亂、不清晰，故很難獲得滿意的電鏡圖片。其原因可能是浮游病毒和水中的其它浮游生物、細(xì)胞碎片等固體雜質(zhì)混在一起，吸附到銅網(wǎng)上，對(duì)病毒形態(tài)的觀察和圖片拍攝造成干擾。</p><p>　　采用超離法制樣，可得較好的結(jié)果，這是由于在離心力的作用下，一些比病毒顆粒要大的物質(zhì)首先沉降到銅網(wǎng)上，并形成一個(gè)電子密度高且較均勻的背景，為浮游病毒的觀察起托襯作用。值得注意的是，此方法的離心速度較為關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)表明，用

86、25000r/min的轉(zhuǎn)速比較適宜。這是由于用過(guò)大的離心速度，就會(huì)使有蝌蚪狀病毒的尾巴折斷或損傷；而離心速度過(guò)小，則難使體積較小的病毒沉降到銅網(wǎng)上，不能全面真實(shí)地反映待檢水體中浮游病毒的形態(tài)多樣性及含量等情況。另外，每次離心加入待測(cè)水量的多少，要根據(jù)水樣中浮游生物、其它懸浮顆粒物的含量以及湖水的富營(yíng)養(yǎng)化程度等因素來(lái)定。這樣才能使離心到銅網(wǎng)上的樣品分布均勻、數(shù)量適中，能獲得較好的觀察效果。</p><p>　　用磷

87、鎢酸對(duì)浮游病毒進(jìn)行染色，只產(chǎn)生負(fù)染效應(yīng)，由于它與支持膜的粘附作用很弱，染色后的標(biāo)本不能久留，因此，常難以觀察到浮游病毒的精細(xì)結(jié)構(gòu)。當(dāng)我們選用醋酸雙氧鈾溶液作為染色劑時(shí)，由于醋酸雙氧鈾可產(chǎn)生正染和負(fù)染兩種效果在銅網(wǎng)中雜質(zhì)多、背景暗的區(qū)域可觀察到淺色的病毒顆粒；在淺色的背景下則可觀察到深色的病毒顆粒，因此，處理得當(dāng)，就能有效觀察到不同背景條件下的浮游病毒顆粒。同時(shí)，醋酸雙氧鈾容易與支持膜粘附，產(chǎn)生較強(qiáng)的反差，染色后的標(biāo)本較穩(wěn)定，有利于保存。

88、</p><p>　　在建立了適宜浮游病毒制樣和染色方法的基礎(chǔ)上，獲得了不同病毒顆粒形態(tài)的圖片、病毒精細(xì)結(jié)構(gòu)的圖片，這顯示所建立的方法，能簡(jiǎn)便、有效地用于浮游病毒的研究，包括用于浮游病毒的計(jì)數(shù)分析。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 張奇亞.浮游病毒[J].水生生物學(xué)報(bào),2002, 26(6): 121-

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108、設(shè)計(jì)、實(shí)施到最后論文的分析與討論，導(dǎo)師都傾注了大量的心血，是她給了我極大的幫助，尤其是導(dǎo)師公務(wù)繁忙，但時(shí)刻不忘記、不放松對(duì)我的嚴(yán)格要求，時(shí)刻關(guān)心我的論文進(jìn)展情況。令我佩服的是導(dǎo)師才思敏捷，專業(yè)知識(shí)豐富，勤于思考和治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無(wú)華、平易近人的人格魅力。不僅使我樹(shù)立了遠(yuǎn)大的學(xué)術(shù)目標(biāo)、掌握了基本的研究方法，還使我明白了許多待人接物與為人處世的道理。之前我對(duì)這個(gè)課題并不十分了解，但在