納米二氧化硅對HaCaT細(xì)胞的損傷效應(yīng)及其機制研究.pdf

1、目的：了解納米二氧化硅的皮膚毒性，評價納米二氧化硅的生物安全性提供實驗依據(jù)。為全面評價納米材料的安全性提供依據(jù)，也為建立起更加快速、靈敏、高效的安全性評價方法提供新思路。
　　 方法：⑴設(shè)置溶劑(Ctrl)對照組、微米SiO2對照組(劑量同nm-SiO2最高劑量組，micro-SiO2)、nm-SiO2低劑量組(15nm、30nm、100nm)、nm-SiO2中劑量組(15nm、30nm、100nm)和nm-SiO2高劑量組(1

2、5nm、30nm、100nm)11個劑量組。對micro-SiO2及不同粒徑的nm-SiO2進行表征(粒徑分布、純度、zeta電位、透射電鏡圖)；細(xì)胞生物效應(yīng)的觀察指標(biāo)包括細(xì)胞增殖、LDH的漏出率、DNA損傷(8-OHdG、γH2AX、Comet assay)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、活性氧(ROS)的產(chǎn)生以及氧化應(yīng)激、損傷修復(fù)等相關(guān)基因的表達(dá)，處理時間均為24h。⑵在亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA的基礎(chǔ)上，以甲基化特異性PCR(MSP)檢測P

3、53，P16，OGG1、PARP-1、MYH、MTH1啟動子區(qū)域的甲基化狀況；同時對對照組細(xì)胞，10μg/mL nm-SiO2的暴露HaCaT、HaCaT-shPARP-1、HaCaT-PARP-1細(xì)胞組的PARP-1、MYH啟動子區(qū)域的部分CpG島進行亞硫酸氫鹽克隆測序，全面觀察其CpG島甲基化修飾狀況。⑶以染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合定量PCR的方法檢測DNMT1、PARP-1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的核糖基化及甲基化修飾情況。
　　 結(jié)果：

4、
　　 ⑴用0-100μg/mL nm-SiO2處理HaCaT細(xì)胞24h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的存活率呈劑量依賴性降低，且與粒徑呈反比。用一般概率模型法計算15nm、30 nm及100 nm的nm-SiO2作用于HaCaT細(xì)胞24h的IC50分別為19.43±1.3μg/mL、27.67±1.44μg/mL和35.91±1.59μg/mL。說明處理24h后nm-SiO2對HaCaT細(xì)胞存在著損害效應(yīng)。除細(xì)胞周期外，nm-SiO2所引起的效應(yīng)

5、均比micro-SiO2嚴(yán)重，說明SiO2粒徑尺度的改變對其毒性有顯著影響，可能與胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生水平有關(guān)。Q-PCR和Westernblot結(jié)果都提示PARP-1在nm-SiO2致HaCaT細(xì)胞的損傷中有重要作用。
　　 ⑵在nm-SiO2致HaCaT細(xì)胞損傷的過程中，5-mC免疫熒光及熒光強度的流式檢測結(jié)果都提示DNA的總體甲基化程度有隨nm-SiO2濃度升高而降低的趨勢。同劑量的納米級對照組比溶劑對照組及微米級對照組相比具

6、有更低的基因組DNA甲基化水平。而PARP-1缺陷組有比10μg/mL nm-SiO2處理組更高的甲基化水平，而PARP-1過表達(dá)HaCaT-PARP-1組的5-mC水平則較低。用HPCE電泳檢測HaCaT細(xì)胞的總體甲基化水平，結(jié)果則顯示nm-SiO2可引起HaCaT細(xì)胞甲基化程度降低，呈劑量依賴性關(guān)系；與正常細(xì)胞相比，micro-SiO2、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL分別降低37.8％、43.9％、54.9％、52.

7、8％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)與甲基化免疫熒光結(jié)果相似。對照組5-aza-dC處理后使HaCaT細(xì)胞甲基化程度減少27.3％，而相同的劑量下HaCaT-shPARP-1組則比10μg/mL組升高260.4％，而HaCaT-PARP-1組與10μg/mL組沒有明顯差別。
　　 ⑶細(xì)胞免疫熒光結(jié)果及流式分析結(jié)果均顯示在nm-SiO2致HaCaT細(xì)胞損傷的過程中，PAR的免疫熒光結(jié)果都提示總體核糖基化的程度有隨nm-SiO2

8、濃度升高而升高的趨勢。與溶劑對照組細(xì)胞(Ctrl)相比，micro-SiO2組的熒光強度為19.11，nm-SiO2染毒組(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)細(xì)胞組的熒光強度為20.54、26.54、37.59，而HaCaT-shPARP-1和HaCaT-PARP-1組則為7.01和49.44；對于3μM甲基化酶抑制劑DAC組則為40.21。應(yīng)用PARPs檢測試劑盒，觀察nm-SiO2致HaCaT細(xì)胞損傷的過程中PARPs

9、活性的變化趨勢，與溶劑對照組細(xì)胞(Ctrl)相比，nm-SiO2染毒組(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)細(xì)胞的活性分別升高為28％、37％、70％，HaCaT-PARP-1組則相比對照組升高574％；對于3μM甲基化酶抑制劑DAC組則與對照組變化不明顯。HaCaT細(xì)胞暴露于不同劑量的SiO2中，PARP-1的mRNA相對表達(dá)水平均以溶劑對照組細(xì)胞的表達(dá)量為對照，設(shè)其為1，其余各組的表達(dá)水平與之相比較，nm-SiO2染毒組

10、(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)PARP-1的表達(dá)水平分別為對照組的93.2％、57.6％、23.5％，而HaCaT-shPARP-1和HaCaT-PARP-1組則為對照組的11.2％和534％；對于3μM甲基化酶抑制劑DAC組與對照組變化則為21.5％，micro-SiO2則與對照組沒有差別。
　　 ⑷甲基化特異性PCR(MSP)結(jié)果顯示在HaCaT細(xì)胞暴露于nm-SiO2的過程中，各劑量組的P53均未出現(xiàn)甲

11、基化片段的擴增，但非甲基化擴增水平有隨劑量上升而下降的趨勢，對于P16，不同劑量組的細(xì)胞均具有不同程度的甲基化水平的擴增，呈現(xiàn)隨增劑量的增大有升高的趨勢，而PARP-1過表達(dá)細(xì)胞組HaCaT-PARP-1的甲基化程度最高。隨著nm-SiO2劑量的增大，OGG1啟動子區(qū)的未甲基化程度不斷的升高，PARP-1過表達(dá)細(xì)胞株HaCaT-shPARP-1的未甲基化水平最高。對于MTH1，不同劑量的細(xì)胞均具有不同程度的未甲基化水平的擴增，但隨劑量的

12、增大而變化的趨勢不是很明顯，但DAC組未甲基化程度明顯增強與DNMT1缺陷細(xì)胞相似。而PARP-1缺陷細(xì)胞HaCaT-shPARP-1在MTH1啟動子區(qū)的未甲化程度比PARP-1過表達(dá)細(xì)胞稍高，過表達(dá)細(xì)胞組HaCaT-PARP-1的甲基化程度最高。對于MYH，不同劑量的細(xì)胞組甲基化與未甲基化均有不同程度的擴增，但隨著劑量的增加甲基化程度有不同程度的增高，而PARP-1缺陷細(xì)胞H-shPARP-1的啟動子區(qū)的甲基化程度明顯增加，而PARP

13、-1過表達(dá)細(xì)胞組HaCaT-PARP-1和DNMT1缺陷細(xì)胞株HaCaT-shDNMT-1組只有甲基化程度的擴增而未見未甲基化片段的擴增。隨著nm-SiO2劑量的增大，PARP-1啟動子區(qū)的未甲基化程度不斷的降低。亞硫酸氫鹽測序結(jié)果顯示PARP-1的啟動子區(qū)的甲基化程度很低，但其變化主要發(fā)生在-229位的CG位點上，可能這一位點的甲基化程度與PARP-1的表達(dá)有關(guān)，MYH啟動子區(qū)的甲基化程度都很高，可能此區(qū)的甲基化狀態(tài)并不參與MYH基因

14、表達(dá)的調(diào)控。
　　 ⑸定量染色質(zhì)免疫沉淀(Q-CHIP)結(jié)果提示DNMT1和PARP-1的上游啟動子區(qū)均有不同程度的核糖基和甲基化修飾，其可能參與DNMT1和PARP-1活性的調(diào)控，也可能具有表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用。
　　 結(jié)論：① nm-SiO2具有顯著的HaCaT細(xì)胞毒性。除細(xì)胞周期外，nm-SiO2所引起的效應(yīng)均比micro-SiO2嚴(yán)重，說明SiO2粒徑尺度的改變對其毒性有顯著影響。Nm-SiO2能造成顯著的DNA損

15、傷，且損傷效應(yīng)可能與胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧有關(guān)，PARP-1可能在nm-SiO2致HaCaT細(xì)胞的損傷中有著重要作用。②nm-SiO2處理HaCaT細(xì)胞24h后，可引起整體基因組DNA甲基化降低，總體核糖基化升高，表觀遺傳學(xué)相關(guān)酶的表達(dá)與活性改變參與其形成與維持。③在HaCaT細(xì)胞暴露于nm-SiO2的過程中，特異基因表達(dá)發(fā)生變化，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域特定的DNA甲基化和核糖基化修飾參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。④納米材料可以引起表觀遺傳學(xué)效應(yīng)指標(biāo)的改變，提