增殖細(xì)胞核抗原基因作為東海原甲藻生長(zhǎng)指標(biāo)的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、對(duì)浮游藻現(xiàn)場(chǎng)生長(zhǎng)率等基本生理生態(tài)學(xué)參數(shù)的測(cè)定，是估算浮游藻類(lèi)生產(chǎn)力、研究浮游藻種群變遷、構(gòu)建生態(tài)動(dòng)力學(xué)模型乃至赤潮預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)室之前的研究工作中發(fā)現(xiàn)，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)基因相對(duì)表達(dá)量可以作為指示其生長(zhǎng)率變化的良好指標(biāo)，并建立了中肋骨條藻和東海原甲藻PCNA基因相對(duì)表達(dá)量與其現(xiàn)場(chǎng)生長(zhǎng)率之間的定量關(guān)系。為這兩種赤潮的監(jiān)測(cè)和預(yù)報(bào)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　

2、本研究在之前研究的基礎(chǔ)上，著力于將該方法應(yīng)用到對(duì)現(xiàn)場(chǎng)樣品進(jìn)行生長(zhǎng)率的測(cè)定。分別從現(xiàn)場(chǎng)樣品的采集方式、RNA提取方法、內(nèi)參基因引物的特異性、定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化等幾個(gè)方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在對(duì)舟山外海東海原甲藻赤潮區(qū)的生長(zhǎng)率現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定中，對(duì)建立的PCNA相對(duì)表達(dá)量法進(jìn)行了驗(yàn)證并應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)，為將該方法用于對(duì)赤潮的快速監(jiān)測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)從樣品量、研磨方法、濾膜規(guī)格和提取試劑四個(gè)方面對(duì)RNA提取

3、效率的影響進(jìn)行條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。確定了最小樣品量為2×106個(gè)細(xì)胞；在進(jìn)行過(guò)濾時(shí)可選用孔徑為10μm的醋酸纖維濾膜收集樣品；對(duì)膜樣處理時(shí)，既可將濾膜直接用液氮研磨，也可將樣品從濾膜上刮取下后再用液氮研磨，具體磨樣方式視樣品情況而定；提取試劑以TRIZOL法為優(yōu)。
　　 (2)通過(guò)將東海原甲藻細(xì)胞色素b(Cyt b)基因做序列比對(duì)，設(shè)計(jì)出符合實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)要求的引物，并以14種藻為參照藻，對(duì)所設(shè)計(jì)的引物的特異性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明其

4、有較好的特異性。優(yōu)化了反應(yīng)體系，在20μL的反轉(zhuǎn)錄體系中，適宜的反轉(zhuǎn)錄RNA量為50 ng～200 ng：PCR模板稀釋10倍或向定量PCR反應(yīng)體系中加入終濃度為0.2μg/L的牛血清蛋白(BSA)均能有效地降低現(xiàn)場(chǎng)樣品中抑制物的抑制作用，減小干擾。采用SYBR GreenⅠ染料法建立了檢測(cè)東海原甲藻Cytb基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的曲線方程為：Ct=-3.44×lg[基因拷貝數(shù)]+36.53，其相關(guān)系數(shù)r=0.999。

5、
　　 (3)將PCNA相對(duì)表達(dá)量法與現(xiàn)場(chǎng)培養(yǎng)法所得的生長(zhǎng)率作比較，發(fā)現(xiàn)二者具有很好的一致性，都能反映現(xiàn)場(chǎng)水體中赤潮生物的原位生長(zhǎng)情況。將該方法應(yīng)用到2011年春季長(zhǎng)江口外和舟山外海赤潮發(fā)生區(qū)的東海原甲藻生長(zhǎng)率現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)多數(shù)站位生長(zhǎng)率為負(fù)值，表明此次赤潮已經(jīng)進(jìn)入消亡階段。
　　 本研究將PCNA相對(duì)表達(dá)量法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)，對(duì)東海原甲藻赤潮進(jìn)行生長(zhǎng)率測(cè)定，很好地反映了赤潮的生長(zhǎng)狀況和發(fā)展趨勢(shì)，為運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)赤潮進(jìn)行