動物檢疫技術(shù)

1、1,第五章 動物檢驗(yàn)檢疫技術(shù),第一節(jié) 檢驗(yàn)檢疫樣品第二節(jié) 細(xì)菌分離及鑒定第三節(jié) 病毒分離及鑒定第四節(jié) 其他病毒微生物分離及鑒定第五節(jié) 寄生蟲檢查第六節(jié) 現(xiàn)代生物技術(shù)在動物檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用,2,第一節(jié) 檢驗(yàn)檢疫樣品,一、病料采集和運(yùn)送1、在采取病料前必須對被檢動物可能患有何種疫病作出初步診斷；2、采取病料所用的容器、手術(shù)器械均應(yīng)滅菌后才能使用，采樣時應(yīng)無菌操作；3、解剖前檢查（只有在確定不是炭疽后，方可剖解）；4、取材

2、時間要早（死后6h內(nèi)）；5、應(yīng)根據(jù)不同的疫病相應(yīng)的采取臟器或內(nèi)容物；若無法估計是某種疫病，可全面的采取。（膿汁、血液、皮膚、骨頭、腦、脊髓等）,3,二、病料的保存,（一）細(xì)菌檢驗(yàn)材料的保存臟器組織塊→保存于飽和氯化鈉溶液或30%甘油緩沖鹽溶液中→容器加塞封固。液體→裝地封閉的毛細(xì)玻管或試管運(yùn)送。生前由直腸中采集的糞團(tuán)→裝入滅菌容器中寄送。（二）病毒檢驗(yàn)材料的保存臟器組織塊→保存于50%甘油緩沖鹽溶液或雞蛋生理鹽水中→容器加塞

3、封固。（三）病理組織學(xué)檢驗(yàn)材料的保存臟器組織塊→放入10%福爾馬林溶液或95%酒精中固定，固定液用量應(yīng)為病料的10倍。,4,三、病料的記錄、包裝和運(yùn)送方法,（一）送檢單填寫3份，一份存根，兩份寄送檢驗(yàn)室；待檢查完畢后退回1份。（二）病料的包裝和運(yùn)送液體病料（如黏液、滲出液、尿及膽汁等）→裝入細(xì)玻璃管中（管口用火焰封閉）→再用廢紙或棉花包囊裝入較大的試管中→再裝入木盒中運(yùn)送。組織塊或臟器,,,5,第二節(jié) 細(xì)菌分離及鑒定,細(xì)菌分

4、離及鑒定是用人工的方法使細(xì)菌在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和營養(yǎng)基質(zhì)中生長繁殖，獲取純種、進(jìn)行鑒定與研究等。為達(dá)到細(xì)菌分離及鑒定的目的，運(yùn)用無菌技術(shù)提供適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基適宜的培養(yǎng)方法和條件,6,六、細(xì)菌的分離接種平板劃線接種法斜面接種法傾注培養(yǎng)法穿刺培養(yǎng)法半固體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法平板涂布培養(yǎng)法七、細(xì)菌的培養(yǎng)方法需氧培養(yǎng)法二氧化碳培養(yǎng)法（CO2孵箱法、燭缸法、化學(xué)法）厭氧培養(yǎng)法（厭氧罐培養(yǎng)法、培養(yǎng)箱法）,7,八、細(xì)菌的鑒定,（一）細(xì)

5、菌的生長現(xiàn)象觀察,8,細(xì)菌的一些培養(yǎng)特征,有小刺,在瓊脂穿刺培養(yǎng)中的生長,絨毛狀,假根狀,樹狀,念珠狀,有小刺,念珠狀,假根狀,樹狀,擴(kuò)展?fàn)?絲狀,絲狀,在瓊脂劃線培養(yǎng)上的生長,量杯狀,漏斗狀,囊狀,層狀,蘿卜狀,在明膠穿刺培養(yǎng)中的生長,絮狀,環(huán)狀,膜狀,肉湯表面生長,浮膜狀,9,（二）、細(xì)菌基本形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)的觀察,細(xì)菌基本形態(tài)的觀察細(xì)菌基本形態(tài)：球狀、桿狀和螺旋狀。細(xì)菌基本結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)。細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛

6、、芽孢、莢膜等。均需染色方可在顯微鏡下觀察，染色方法有：簡單染色法：只用一種染料進(jìn)行染色。復(fù)雜染色法：革蘭氏染色法抗酸染色法（抗酸菌呈紅色，非抗酸菌呈藍(lán)色）瑞特氏染色法（細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色）姬姆薩氏染色法（細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色）,10,細(xì)菌特殊形態(tài)的觀察,11,（三）生化試驗(yàn),細(xì)菌的生化試驗(yàn)是繼形態(tài)學(xué)鑒定之后，又一重要鑒別依據(jù)。糖類分解試驗(yàn)吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)V-P試驗(yàn)甲基紅（M.R）試驗(yàn)

7、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)?zāi)萄遄吓Ｈ樵囼?yàn)硫化氫試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn),12,（四）、細(xì)菌抗原檢測及血清型鑒定◎ 細(xì)菌抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，有存在于細(xì)胞壁的菌體抗原（O抗原，有運(yùn)動性的細(xì)菌在菌體抗原之外還有鞭毛抗原（H抗原），具有不同種、型特異性?！?血清型鑒定 首先要求鑒定的細(xì)菌必須純凈、新鮮，在適宜條件下培養(yǎng)，盡量減少偉代，以防發(fā)生變異。 其次有特異性強(qiáng)和效價高的已知標(biāo)準(zhǔn)

8、血清（包括單克隆抗體）和標(biāo)準(zhǔn)菌株。（五）、細(xì)菌遺傳物質(zhì)檢測目前比較成熟的遺傳物質(zhì)檢測包括基因探針技術(shù)和PCR技術(shù),13,,（六）、細(xì)菌毒力測定表示細(xì)菌毒力大小的單位有：最小致死量（MLD）：能使特定的動物感染后，在一定時限內(nèi)發(fā)生的最少活的細(xì)菌量或毒素量。半致死量（LD50）：在一定的時限內(nèi)能使半數(shù)實(shí)驗(yàn)動物感染后發(fā)生死亡所需的活的細(xì)菌或毒素量。,14,第三節(jié) 病毒分離及鑒定,檢材的采集與送檢、病料的處理標(biāo)本采取的原則：1

9、. 病毒標(biāo)本的采取應(yīng)盡早為好.2.由于大多數(shù)病毒對熱不穩(wěn)定，應(yīng)該立即接種，如果不能及時接種或需保存，一般置50％甘油鹽水4℃或一20℃以下保存。,15,三、病毒的分離培養(yǎng),一、動物接種培養(yǎng)二、病毒的雞胚培養(yǎng)三、病毒的細(xì)胞培養(yǎng),16,一、動物接種培養(yǎng),動物接種是最原始的病毒培養(yǎng)方法。主要用于目前無法用細(xì)胞、雞胚培養(yǎng)的病毒。常用的動物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、 家兔，有時也用猴、猿、猩猩等。接種時要根據(jù)病毒對動物，組織細(xì)胞等嗜

10、性不同而選 擇特定的部位，如鼻腔、皮內(nèi)、皮下、腹腔、腦內(nèi)、靜脈等。小白鼠腦內(nèi)接種法【材料】 1.腦炎病毒（小白鼠腦脊髓炎）懸液：腦組織先用無菌生理鹽水洗去血液，再加100％脫脂奶水研磨成10毫升懸液，離心沉淀30分鐘，吸取上清液。 2.小白鼠：3周齡，體重6—8克。,17,【方法】,1．1毫升注射器抽取腦炎病毒懸液0.1毫升，去除注射器內(nèi)的氣泡。2．取出小白鼠，左手將小白鼠固定，固定時用大拇指和食指握住小白鼠的頭部，左手掌

11、輕輕按住小白鼠的體部。3．右手以棉簽蘸以碘酒，消毒小白鼠的右頰部皮毛4．右手拿住注射器在小白鼠眼與耳根連線的中點(diǎn)略偏耳朵的方向注入，進(jìn)入顱腔，進(jìn)針2—3毫米，不要插得太深，注射量為0.02—0.03毫升。5．注射完畢，將用過的注射器煮沸消毒，動物一般在3—4天開始發(fā)病，食欲減退，活動遲純、聳毛、振顫、慢慢發(fā)展為麻痹癱瘓而死亡。,18,二、病毒的雞胚培養(yǎng),19,三、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)通過機(jī)械解離或消化等方法將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分

12、散成單個細(xì)胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外能繼續(xù)生長繁殖，稱為細(xì)胞培養(yǎng)。,病毒的細(xì)胞培養(yǎng)步驟：病料處理病毒分離、繁殖細(xì)胞病變（CPE）觀察,20,四、分離病毒的鑒定,（一）病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察（二）病毒核酸類型的測定（三）病毒對幾種類脂的敏感試驗(yàn)（四）病毒對幾種理化因素的抗性測定（五）血吸附和血吸附抑制試驗(yàn)（六）干擾素敏感試驗(yàn)（七）蝕斑形成單位測定（八）病毒毒力的測定（九）血凝試驗(yàn)和血凝抑制試

13、驗(yàn)（十）中和試驗(yàn)（十一）血清學(xué)試驗(yàn),21,（一）病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察,禽流感病毒,狂犬病病毒,22,（二）病毒核酸類型的測定,胸苷酸是病毒DNA合成的重要物質(zhì)，它的鹵素替代物的存在能抑制DNA的合成。【方法】：1、給已長滿細(xì)胞單層6孔板1-4孔每2孔加病毒液3滴；2、置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中1h；3、取出細(xì)胞板，吸出培養(yǎng)液；4、給相應(yīng)的孔加5ml含胸苷酸的類同物的維持液或不含胸苷酸的類同物維持液；5、將細(xì)胞培養(yǎng)板放回C

14、O2培養(yǎng)箱中，每天觀察細(xì)胞病變（CPE）。,23,（三）病毒對幾種類脂的敏感試驗(yàn),病毒有無包膜，常用脂溶劑氯仿、乙醚或去氧膽酸鈉來處理病毒，看脂溶劑對病毒有無滅活作用而證明病毒有無包膜。以氯仿敏感試驗(yàn)為例：1、將氯仿加于病毒懸液中，使最終濃度達(dá)5%，充分振蕩后在4℃放置10min.2、懸液用2000r/min離心沉淀5min，使氯仿沉于管底。3、吸取上層液，做連續(xù)10倍稀釋。每一稀釋接種4管細(xì)胞培養(yǎng)，滴定組織細(xì)胞半數(shù)感染量（TC

15、ID50）。未經(jīng)氯仿處理的病毒懸液做同樣處理。4、氯仿處理的病毒懸液的感染力如比對照懸液低2.0log以上即可認(rèn)為是敏感。,24,（四）病毒對幾種理化因素的抗性測定,1、熱滅活試驗(yàn) 有些病毒對熱敏感在50 ℃30min被滅活。2、陽離子穩(wěn)定試驗(yàn)高濃度二價離子如MgCl2能穩(wěn)定某些病毒如腸道病毒等，使其在50 ℃60min 不被滅活。另一些病毒如腺病毒等則增加對熱的敏感性。3、酸敏感試驗(yàn)在pH3溶液中經(jīng)30min

16、能降低某些病毒的感染力如口蹄疫病毒，而對另一些病毒如豬水皰病毒等沒有作用。,25,（五）血吸附和血吸附抑制試驗(yàn),細(xì)胞培養(yǎng)被某些病毒感染后，不論有無細(xì)胞病變，能吸附一些動物的紅細(xì)胞。能凝集紅細(xì)胞的病毒，一般具有血吸附作用。也有些例外，如部分腸道病毒有血凝作用但無血吸附現(xiàn)象；相反非洲豬瘟病毒雖不顯示血凝活性，但卻有血吸附作用。,26,（六）干擾素敏感試驗(yàn),干擾素是具有高度生物活性的細(xì)胞產(chǎn)物，能促使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，干擾病毒的增殖，減少細(xì)

17、胞CPE產(chǎn)生。,27,（七）蝕斑形成單位測定,病毒蝕斑(又叫空斑)如同噬菌體的噬斑，一個蝕斑為一個病毒體的繁殖后代品系。在細(xì)胞培養(yǎng)中做蝕斑是一種較精確地測定病毒感染力的方法?！痉椒ā浚?、將病毒各稀釋度種入單層細(xì)胞瓶，吸附1小時后，在單層細(xì)胞上復(fù)以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，病毒在細(xì)胞中繁殖使細(xì)胞死亡。但由于瓊脂的限制只能感染鄰近的細(xì)胞，形成“蝕斑”的退化細(xì)胞區(qū)。2、經(jīng)中性紅活細(xì)胞染料著色后，活細(xì)胞顯紅色，而蝕斑區(qū)細(xì)胞已退化不著色，形成不染色

18、區(qū)域。3、凡是能在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生細(xì)胞死亡破裂現(xiàn)象（CPE）的病毒都可采用蝕斑技術(shù)來分離和測定。,28,（八）病毒毒力的測定,衡量病毒毒力（毒價）的單位過去多用最小致死量（MLD）?，F(xiàn)多改用半數(shù)致死量（LD50）。用雞胚測定時，毒價單位為雞胚半數(shù)致死量（ELD50）或雞胚半數(shù)感染量（ELD50）。用細(xì)胞培養(yǎng)測定時，用組織細(xì)胞半數(shù)感染量（ELD50）。,29,（九）血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn),某些病毒（A型流感病毒、雞新城域病毒等）由于

19、具有血凝素，可以使雞或其他一些動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集。如果在這些病毒懸液中先加入特異性的免疫血清，則病毒凝集紅細(xì)胞的作用被抑制。紅細(xì)胞凝集極凝集抑制試驗(yàn)常用于測定病毒的含量及病毒的鑒定等。,30,第四節(jié) 其他病原微生物分離及鑒定,一、螺旋體 螺旋體是一類菌體細(xì)長、 柔軟、彎曲呈螺旋狀，能活潑運(yùn)動的原核單細(xì)胞微生物?；窘Y(jié)構(gòu)與細(xì)菌類似。從有疑似急性螺旋體病癥狀的動物的血液和乳液中分離到螺旋體是有診斷價值的。但從血液中分離有一

20、定難度，因?yàn)榫Y和臨床癥狀往往不是同時出現(xiàn)。（一）病料的采集與檢查（暗視野）（二）分離培養(yǎng)（三）動物感染試驗(yàn)（四）血清學(xué)試驗(yàn),31,二、立克次氏體,立克次氏體是介于細(xì)菌和病毒之間的一類微生物，除少數(shù)成員外，大多為嚴(yán)格的細(xì)胞寄生性微生物。革蘭氏染色陰性。微生物學(xué)診斷：病原的分離鑒定和動物血清中特異性抗體的檢測。有些立克次氏體如Q熱立克次氏體，對人有很強(qiáng)的傳染性。在進(jìn)行有關(guān)活立克次氏體的操作實(shí)驗(yàn)時應(yīng)有完善的隔離防護(hù)設(shè)施和條件。

21、,32,三、支原體,支原體是能在無活細(xì)胞培養(yǎng)基中繁殖的最小微生物，它是一類無細(xì)胞壁，僅由三層薄膜組成的細(xì)胞膜，胞質(zhì)內(nèi)有顆粒狀核糖體，雙股DNA的原核細(xì)胞。菌體形態(tài)呈高度多形性，有球狀、桿狀、環(huán)狀、絲狀等。革蘭氏染色陰性，但較難著色。姬母薩氏法染色良好，呈淡紫色。,支原體菌落,33,四、衣原體,衣原體是一類專性嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生活的微生物，不能在細(xì)菌培養(yǎng)基上生長繁殖；在光學(xué)顯微鏡下可以被觀察到。衣原體屬中與動物有病原關(guān)系的主要為鸚鵡衣

22、原體，它可引起畜禽的多種疾病，要確診其病原，需進(jìn)行病原體的分離培養(yǎng)及對分離物作鑒定。最常用的分離培養(yǎng)方法有（1）雞胚卵黃囊接種法（2）小鼠接種法（3）細(xì)胞培養(yǎng)法。,34,第五節(jié) 寄生蟲檢查,一、蟲卵檢查法：蟲卵漂浮法二、蟲體檢查法蠕蟲的成蟲檢查法：生前主要用于絳蟲病疹斷，死后剖檢。蠕蟲的幼蟲檢查法：多用于非腸道寄生蟲或通過蟲卵不易鑒定的寄生蟲三、免疫學(xué)檢測方法免疫沉淀法免疫熒光技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫凝集技術(shù)四、分子生物學(xué)

23、檢測方法,,,35,第六節(jié) 現(xiàn)代生物技術(shù)在動物檢疫中的應(yīng)用,在動物疫病診斷和檢疫中，現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在兩方面：一是基于抗原抗體反應(yīng)的免疫血清學(xué)技術(shù)；二是基于病原核酸檢測分子生物學(xué)技術(shù)。,36,免疫血清學(xué)技術(shù)包括：,中和試驗(yàn)：分離的病毒用已知特異性免疫血清來中和。凝集試驗(yàn)沉淀試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)免疫熒光抗體技術(shù)膠體金標(biāo)記技術(shù) 禽流感新城疫病毒膠體金快速診斷試紙的使用免疫電鏡技術(shù)等病原菌的檢測毒素的檢測藥物殘