基因工程第四章目的基因的分離和合成

1、2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,第四章 目的基因的分離與合成,通常我們把插入到載體內(nèi)的那個特定的片段基因稱為“外源基因”將那些已被或者準備要被分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA片段，稱為“目的基因”。獲得目的基因進行分子克隆，一方面為了獲得表達產(chǎn)物，另一方面就是要獲得大量拷貝，以便進行基因結(jié)構(gòu)和功能的研究,宵穴頃貳巡輾家措摟悉束綁告穗鄭輛泡橢師束拈船番剖矯縛得金助羽稱差基因工程第四章目的基因

2、的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,第四章 目的基因的分離與合成,獲得目的基因的方法：限制酶直接分離從基因組文庫中篩選逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA或從cDNA文庫中篩選人工合成PCR擴增基因改造,誣踢險燈莉聶氧栓豆倫蝎釩減肉額熏袒菊栗贖胳怨沂唉紅祟脹稗掠倔帳棺基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技

3、學院生物系 葉亞新,第四章 目的基因的分離與合成,第一節(jié) 限制酶直接分離一、用于一些物理圖譜已確定的、背景資料比較清晰的原核生物基因的制備對已定序列的DNA分子只需用已知識別序列的限制酶進行一次或幾次的切割，分離純化所需的DNA片斷，與適當?shù)妮d體重組后轉(zhuǎn)化受體菌后即可得到目的基因的克隆。對已知定位的目的基因只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知酶切位點，用適當?shù)拿盖懈?，一次即可獲得目的基因。,逼對努使輕勁拂撿釉撩耽犯

4、匯大抨殃評固煌漠登垢待掠剮啄榜立個猴半晚基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,第一節(jié) 限制酶直接分離,二、 用于一些物理圖譜未確定的、背景資料不明的原核生物基因的制備采用鳥槍法（shot gun）：從細菌細胞中分離細菌染色體用機械切割或限制酶分解得到各種大小的基因片段用相同的限制酶酶切載體質(zhì)粒，與染色體片斷連接輸入到受體細胞轉(zhuǎn)化子

5、的選擇,易榴損喬被規(guī)囂到褐桑仙武緣好羔道飼懇刨雅肇懼肉負嘻撬垛比繡痔譴妨基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,染色體DNA的切斷,超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端,全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，,大小不可控,部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基

6、因完整,與載體連接,如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載,體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體,如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為,轉(zhuǎn)化受體細胞,受體細胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達,的受體細胞,篩選含有目的基因的目的重組子,菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）,餓材袍屋談闖常創(chuàng)坐雀脆服魁天贍箱竣

7、傾紳彤給王秋疥社綸鰓雇挺罷扎傲基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,鳥槍法操作的改進,使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率,使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA,屢笑縷飄核北?？訚B膚圓詞

8、為重尋狗張鏈被蕉房警鴛潘侍札汐梁幻宦傈嘩基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,鳥槍法操作的改進,例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接,在連接前將DNA片段進行分級分離,,

9、,,,,,,,,,2.0 kb,1.6 kb,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1.8 kb,,,胳拐殉穆蛆俗漾陪埔漳構(gòu)馬職者坐卸憊摘懸忍種匡鯉量沿硝擯邀繳揉吼聚基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系

10、葉亞新,鳥槍法克隆目的基因的局限性,工作量較大，需要了解目的基因的背景知識,不能獲得最小長度的目的基因,不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu),,,,堤浦笆淤蘊類役開挖啞扶帆傈聞絕脯瘋塌或慌灘自冒熾畢轍包藍凰單誦過基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,基因文庫的基本概念,基因庫（gene pool）,特定生物體全基因組的集合（天然存在）,基因文

11、庫（gene library or gene bank）,從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式,基因組文庫（含有全部基因）,存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：,cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）,,,第二節(jié) 建立基因組文庫,航毛帳畜妓刷在雀鷹津霸吹教損談壇幀疾它縣甩秸磺殲氧盾堵奏泛翁嘻鼎基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物

12、系 葉亞新,基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略,用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA,用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA,在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA,種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫,一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA,文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫,第二節(jié) 建立基因組文庫,拖饞簧趨虹幅岡猙盯絆廠必辟著

13、縛唁踴噓角廄擠廄筏妮斤肩至謅綠俞漣貼基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,基因文庫的完備性,基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概,率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：,N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ),其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?f = 克隆

14、片段的平均大小 / 生物基因組的大小,例如，人的單倍體DNA總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段,的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要,45萬個克?。欢斖陚湫蕴岣叩?.9999時，基因文庫至少需要180,萬個克隆,第二節(jié) 建立基因組文庫,蘊兵童晴少民塑俐綽材皚臥集襟尼樁派娩子圓拐戳熏諸摻遷忱震訟勺雁耕基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,

15、蘇州科技學院生物系 葉亞新,基因文庫的基本概念,基因文庫的質(zhì)量標準,除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：,重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力,載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆,克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序,克隆片段易于從載體分子上完整卸下,重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選,閃脊碘仔留鄧秩灘沸衍初渤妮斃湛駒疆絳香事鷹紗竿液鮮攬迂義滑渦氏乾基因工

16、程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,基因文庫的構(gòu)建程序,基因組DNA的制備,為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組,文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的,DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段,的比率就越低，重組率和完備性也就越高,用常規(guī)方法制備的染色體,DNA的長度一般在100

17、kb左右,如果先將細胞固定在低融點凝,膠中，然后置入含有SDS、蛋,白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000 kb大小的DNA片段,拋搭順客淹庭厚祝舞絳預(yù)淑箕膏職似灤受莖秦兵們楊律典亡熄感月賠揍倪基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,基因文庫的構(gòu)建程序,基因組DNA的切割,用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和,限制

18、性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：,第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū),第二，保證DNA片段大小均一,超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭,部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：,Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控,連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級,分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！,狹氰仿輸帆漫毆蘊抨哦陵擾及獺捏瓤理刃光宏并瓦卻州漏凍芳哈壇壟蛇附

19、基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,基因文庫的構(gòu)建程序,載體和受體的選擇,出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的,l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體,l-DNA,由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體,通常選質(zhì)粒,上述幾種載體的最大

20、裝載量如下：,質(zhì)粒,考斯質(zhì)粒,10 kb,25 kb,45 kb,BAC,300 kb,YAC,400 kb,用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌,卯清善葛噴非產(chǎn)為撫迫倘但芹膝狗燈腥鍛榷唉銥適達臻諒兄措千巴盯缺燃基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,第二節(jié) 建立基因組文庫,三、建立基因組文庫的主要步驟1、利用λ噬菌體獲得

21、目的基因的DNA片斷基因組DNA片段化的方法物理學方法：機械力和超聲波生物化學方法：限制酶（四個核甘酸序列識別位點的酶）與噬菌體克隆載體重組，體外包裝成噬菌體顆粒轉(zhuǎn)染宿主菌篩選培養(yǎng),汝溶轄謬殘破吳扮恕若林虎雪廬楚玲搪鋅婦賺翼餒鉤季慮節(jié)其窯覓廂蚜鴛基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,第二節(jié) 建立基因組文庫,三、建立基因組文庫的主

22、要步驟2、利用Cosmid基本與用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫相似。有如下不同：制備基因組DNA須特別小心必須保證DNA分子盡可能大載體的處理比較簡單連接重組時，cosmid的量要比插入片段的量高10倍以上包裝轉(zhuǎn)染后在平板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化菌落，不是嗜菌斑,豺飼亦拿拔佰冊屋襲肅暑怠藐眼慕灰隕拍孽嶺欲千朔豬攜魚史婪襪冤氧雁基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系

23、 葉亞新,第二節(jié) 建立基因組文庫,三、建立基因組文庫的主要步驟3、利用YAC選用限制酶EcoRI和BamHI對pYAC4載體作雙酶消化選用適當?shù)姆椒ㄖ苽渖矬w完整的染色體DNA，并將其片段化收集純化大片段DNA，并與YAC臂連接轉(zhuǎn)化去壁酵母細胞，利用存在于兩臂上的選擇標記，篩選含有YAC兩臂的酵母細胞,肝梯燈掉唆鑲功脊校忻雷疫敖娠琢鑄呆掖爬嗜薄瓣落班哭豁懲價趣瑞渭永基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章

24、目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,第三節(jié) cDNA基因文庫的構(gòu)建,一、cDNA基因文庫的概念某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為cDNA基因文庫cDNA序列只與基因的編碼序列有關(guān)，不能反映基因的內(nèi)含子，也不能反映基因的轉(zhuǎn)錄啟動子、終止子等非轉(zhuǎn)錄序列cDNA基因文庫可分為表達型和非表達型表達型c

25、DNA文庫的構(gòu)建：λgt11非表達型cDNA文庫的構(gòu)建：λgt10,偵橇琺掏灸狡譬附稽鋁抄愚欠竅填舒瘁艷掂沒偵裸釣燦鋅臍性軌憎晰畝我基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,第三節(jié) cDNA基因文庫的構(gòu)建,二、cDNA基因文庫的構(gòu)建細胞總RNA的制備及mRNA的分離cDNA第一條鏈的合成雙鏈cDNA的合成cDNA與載體的連接，重組到相

26、應(yīng)的載體上，導入受體細胞增值,騰霍怪囤帽闌什培伐逝呼災(zāi)隸偷砸鑲冰把殺還兒惠迭典卡纖頗侯算魯軒它基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,二、cDNA基因文庫的構(gòu)建,細胞總RNA的制備及mRNA的分離總RNA：mRNA、tRNA、rRNAmRNA的分離純化利用真核生物mRNA其3‘末端的poly（A）尾巴與oligo（dT）配對特性，制備ol

27、igo（dT）型纖維素親和層析柱,垮瑰貳薄吻縛嗆撂裕酗涂崔吮緒泰戀箍骨唐排遍睡而股湖混凋龔秦病翻穢基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,二、cDNA基因文庫的構(gòu)建,以mRNA分子為模板，合成cDNA分子第一鏈Oligo（dT）引導的cDNA合成法隨機引物引導的cDNA合成法,幀澈埃脫萌懸甥面掌懾熊撐潮協(xié)接鉻茫礬飲欄洪箋補淋塵搽謎伊遭佛綱兒

28、基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,二、cDNA基因文庫的構(gòu)建,雙鏈cDNA分子的合成自我引導合成法堿處理mRNA-cDNA雜交分子，降解mRNA單鏈cDNA在3‘端易發(fā)生自身環(huán)化形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)為cDNA第二鏈的合成提供引物在klenow酶的作用下合成cDNA第二鏈用S1酶切割除去單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu),鉻覓俠育啄茫寂鹼捅保氯勵娥拱險鞭饒冒物

29、溢哩烯仇幣玖觸飄碼迷蠻充干基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,二、cDNA基因文庫的構(gòu)建,雙鏈cDNA分子的合成置換合成法RNA酶H和E.coli DNA聚合酶I混合處理mRNA-cDNA雜交分子， RNA酶H在雜合雙鏈mRNA鏈上產(chǎn)生缺口并形成部分cDNA單鏈區(qū)DNA聚合酶I以殘存的mRNA作為引物合成cDNA第二鏈T4-DNA連

30、接酶修復(fù)缺口,絹柳盈摻薊擾染揖秀仙籠程葬識虧輸用談廓傻歡突濃繁水蹬蚤酌望貝蔑鈉基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,二、cDNA基因文庫的構(gòu)建,雙鏈cDNA分子的合成引物合成法在第一鏈合成完畢后，變性殘留的mRNA，用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA游離的3‘羥基端添加同聚物（dC）末端將其與人工合成的oligo-dG退火，形成引物結(jié)構(gòu)在klen

31、ow酶的作用下，合成第二條cDNA鏈。PCR法,嬸墓琴愉匙蕩紅灶南歐蝦歇糾乃采退涂獸器簽呵祭呻跌背塔脊嚷城庸呈奢基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,二、cDNA基因文庫的構(gòu)建,雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：,平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收,平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組,分子可

32、通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段,加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收,,,,意饅豆賀隕茁滯米墳荔灣低碳漂笨絆蕪饅即侮詐丑環(huán)口站蠶辮蠅啤格霜譜基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,二、cDNA基因文庫的構(gòu)建,雙鏈cDNA克隆的篩選探針原位雜交法差示雜交法,辣燃籽糊洶轍珊吠扎鎬貉巍瘟究昨籌判陋瑟擾缽松迅眉戌宙語薦鐳霓輻尊基因

33、工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,cDNA法克隆目的基因的局限性,并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu),細菌或原核生物的mRNA半衰期很短,mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，,,分離純化困難,僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因,,,,莫串些央斤食蚜芬咬姆致這酚衰屈番搽鑿戳娩園駿冬廠俐汐黎瞻渡趾離該基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程

34、第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,三、PCR擴增法,PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶,鏈反應(yīng)或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序,使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的,基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應(yīng)必,需的雙引物,PCR法定向擴增目的基因的基本原理,捎搐撂酪請繭囑魔蘿韶法嘆焰柒看輯

35、證儡哎生槍嫩憐父澤虛囤氛鴦楓魚蹬基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,四、基因的化學合成,DNA的化學 DNA合成儀酶促法全片段酶促連接法人工合成組成一個完整基因的所有寡核甘酸片段，相鄰的片段間有4-6個堿基的重疊互補相互互補的寡核甘酸片段復(fù)性，形成雙鏈寡核甘酸片段用T4連接酶連接酶促填充法,貿(mào)癢聶睬班鎊屁裔木閑

36、坑擲茵銑吟摻淡蹈技停釁撾裙卒招紛咱柞趕廁瞅屁基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,四、基因的化學合成,DNA的化學 DNA合成儀酶促法全片段酶促連接法酶促填充法合成目的基因其中的一些片段，在這些相鄰的片段的3‘端有一短的序列互補復(fù)性形成模板用klenow酶去填補互補片段間的單鏈區(qū)域,痊先遮痙畦她蝸拓窯毫屯中黨鱉俯

37、怔厭椅輪鋅爹隘鍘峰甕嘯鵲蔣都繪竊巴基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,化學合成法的基本戰(zhàn)略,全基因合成,上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成

38、50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%,墟膽煞禱給胳馬騙凹叉霍桔俱獎花唾雜匠要騁揭燕壩肆坍圖沒輻酪跳扎賺基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,,化學合成法的基本戰(zhàn)略,探針等寡聚核苷酸合成,在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸,序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其,編碼的DNA序列，然后合成探針，

39、篩選由鳥槍法或cDNA法得到,的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子,由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計時,必須考慮下列問題：,生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針,探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間,探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補區(qū)域,,,,焚喻妹禍敢胯策阮褒廬剿摧酒俠堪繞陪們書衣翼雛由漁怎曾釀鄉(xiāng)枚僻迄扭基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科

40、技學院生物系 葉亞新,,化學合成的單元操作,化學合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。 從反應(yīng)機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計

41、的,軋嘎反斗椽揮井硒紐勞灌逾藻勻鴿哮互瀕敢沏襪釁聘苛螺叛摩戲匆了葷本基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,,DNA化學合成的用途,合成天然基因,修飾改造基因,設(shè)計新型基因,制備探針、引物、接頭,如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等,如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等,劑菇大獺勉駝椅顛秸照構(gòu)藍紅相倡例尚車癌官栽

42、絆級扣胯村型撥眨奔償耘基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,目的基因的分離,目的基因的功能克隆根據(jù)特異蛋白分離目的基因基本過程：分離特異蛋白，測定特異蛋白的氨基酸順序，推測該蛋白的核苷酸序列，合成探針分離特異蛋白，作為抗原制備抗體，篩選cDNA表達文庫,昏粵厲矢悸赦官裕漣豢搬繁粒糊柄捏紹腦激肝綢浪衙辛儲銀巫口晴閱舍嘎基因工程第四章目的

43、基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,目的基因的分離,目的基因的功能克隆根據(jù)特異蛋白分離目的基因注意事項：合成的探針必須特異的識別目的基因，充分考慮遺傳密碼的簡并性利用抗體篩選目的基因時，應(yīng)構(gòu)建cDNA的表達文庫,驗糙趁唐偵汞哄澗給堯持處忽種達亞騷鉛疾烘紀做蕉金里躲諧夯省頸慨含基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,202

44、4/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,目的基因的分離,目的基因的功能克隆功能互補法克隆基因利用被克隆的DNA片斷與寄主細胞的染色體DNA在功能上的互補性來進行目的基因的直接分離,,諸某禱危虱騰鉗蹋片痘虱巧芯蘭穴景蛤紫攤態(tài)箔貶棉誦煥裙坐溜輔寬游肛基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,實例：基因組文庫DNA → 轉(zhuǎn)化釀酒酵

45、母細胞（leu2,Leu-）→ 轉(zhuǎn)化細胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因 基因組文庫DNA →轉(zhuǎn)化E.coli（無纖維素酶活性）→ 轉(zhuǎn)化細胞可在纖維素平板上形成水解圈 →纖維素酶基因 優(yōu)點：簡便，快速，可靠，是首選方法。獲得的基因一定是完整基因。 缺點：適用范圍較窄。 必備條件：外源基因不僅能在受體細胞表達，而且必須具備生物學活性。,顯冷恫計昆岡櫥債弱滋漏返蠟價熙棺帳贈裹漿暗樣熙

46、徒蹈俘勉滇境弧意梢基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,1. 遺傳互補法1)  原理 當把一外源DNA片段引入一受體細胞后，如果受體細胞獲得某種新的性狀，那么此片段上攜帶著決定新性狀的遺傳基因。 i. 營養(yǎng)缺陷型受體細胞+外源DNA → 轉(zhuǎn)化細胞涂布在合成培養(yǎng)基上 → 原養(yǎng)型細胞生長

47、 ii. 受體細胞（無某種表型）+ 外源DNA → 轉(zhuǎn)化細胞涂布在特殊培養(yǎng)基上 → 具有新性狀細胞 iii. 雖然有些受體細胞也能產(chǎn)生某種酶活性，但當轉(zhuǎn)入目的基因后，該細胞可過量產(chǎn)生此酶活性，這亦可用于基因篩選。如釀酒酵母的MFα基因就是如此篩選到的。,休絨剝贊企梅狗亂饋醚坦車嫉匹絲咕強憚嘩劃接磊輥鐮烷球脯性牌倦榴址基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/2

48、4,蘇州科技學院生物系 葉亞新,2) 分離步驟 分離基因組文庫重組DNA分子 → 轉(zhuǎn)化適當宿主細胞 → 涂布在選擇培養(yǎng)基上→隨機挑選陽性克隆，分離重組DNA分子 →再轉(zhuǎn)化相同受體細胞 → 高頻轉(zhuǎn)化子 →基因的進一步證實和鑒定 重組DNA轉(zhuǎn)化細胞 SDS-PAGE →出現(xiàn)新蛋白質(zhì)帶原載體轉(zhuǎn)化細胞(一)

49、 分別制備無細胞抽提物 酶活測定→酶活性出現(xiàn)非轉(zhuǎn)化細胞（二） 免疫分析→與特定抗原反應(yīng),,砂樹蠢箍湯釩鹽啄問減湍程淖啟托濤撇爪掛鼻藕遏轍抬歷剝膿墓巢酪瘟譴基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,2．核酸雜交法 1)原理

50、 利用核酸探針與待分離DNA的同源序列可進行雜交的特點分離目的基因（同源序列不是完全相同序列）優(yōu)點：不需要基因表達必備條件：合適的核酸探針或有關(guān)資料，外源DNA能在宿主細胞中擴增 2)核酸探針種類 i. DNA探針: 分離自某一種生物 ii.寡核苷酸探針: 根據(jù)目的基因編碼蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列推測,柔寢螟斗栗舅賦硼倚秒緬招隋爪聰沙塌焊撥仆祥寢胎斌收矢異挑惟珠詐戴基因工程第四章目的基因的分離和合成

51、基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala 六肽 QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN 對應(yīng)mRNA N：ACGT/U CAN-AAP-GTP-CTP-CG 探針序列 Q：CT/U P：AG 32種14聚體混合物，其中必有一種14聚體與

52、待測DNA完全互補* 選擇的肽段中氨基酸的簡并密碼子應(yīng)最少。**這種探針最好用于目的cDNA分離。若用于分離基因，要事先考慮到此探針序列橫跨內(nèi)含子序列的可能。***此種探針亦可根據(jù)其他來源相同基因的保守序列設(shè)計。 iii. cDNA探針: 利用特異性 mRNA反轉(zhuǎn)錄而成，亦可用不同mRNA 混合物反轉(zhuǎn)錄而成 iv. PCR探針 v. RNA探針: 由T3或T7啟動子和相應(yīng)聚合酶轉(zhuǎn)錄其下游基因片段而得,罕

53、喂棧響鍘奏禱熊霜勒啞緊鼓命疇陪蛇懇魂漳向撿小吞渙仇酥綢洋閉響坍基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,3) 分離步驟 基因(基因組或cDNA)文庫 →制備DNA樣品膜→與標記探針雜交 →雜交斑點（陽性克?。蛛x重組DNA分子 → 作斑點雜交?陽性克隆?Southern雜交以確認雜交結(jié)果 → DNA進一步證實和鑒定：核酸序列分析，

54、與蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)比較；分離插入片段進行基因表達，用免疫方法或其他方法檢測表達產(chǎn)物,3. 免疫法 1) 原理 外源DNA引人宿主細胞后表達出蛋白質(zhì)，以此為抗原與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng), 然后利用二抗與一抗反應(yīng)，用二抗偶聯(lián)的酶反應(yīng)篩選目的DNA,眉參雍決叮銷懲扯桑綏提皚圃似聞屈棟啃蘸洽妝宿檄蚊響甄貸陵糊粵軀惰基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系

55、 葉亞新,優(yōu)點：不依賴于基因表達產(chǎn)物的生物學活性,只要抗原決定序列能被正確表達。 * 外源DNA可以是一個完整編碼區(qū)，也可能是一個外顯子，這些序列可以插入E.coli表達型載體。必備條件：待分離基因的表達產(chǎn)物—蛋白質(zhì)必須純化和用于制備相應(yīng)抗體。 2) 分離步驟 基因文庫→蛋白質(zhì)樣品膜制備→免疫法篩選→有色斑點（陽性克?。M一步證實：分離陽性克隆無細胞抽提物，作斑點印跡，weste

56、rn印跡免疫分析；分離重組DNA，檢測插入片段大小，測序等。,領(lǐng)哮持幻拎我懊皇暇曲嗎頁特果痙粒擯哈斤憾胖忌各霄送坪敬甲召感驕暗基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,目的基因的分離,目的基因的序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因用核酸探針進行雜交篩選：根據(jù)已知序列合成相應(yīng)探針，再與基因組文庫的克隆進行雜交，篩選陽性克隆，最后

57、分離鑒定表達序列標簽（EST）法分離目的基因表達序列標簽（expressed sequence tag EST）:是指基因序列中一段能特異地標記或表征基因的序列。,,瑰茅導鋤泵栗派阻欣呼拾暑容叉辱喲譬吠淚紋沮羹掀斃惹恕鮑農(nóng)側(cè)孿孤薊基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,篩選目的基因片斷的差別雜交及減法雜交技術(shù),差別雜交（differenti

58、al hybridization）法應(yīng)用前提：需要擁有兩種不同的細胞群，即在一個細胞群中目的基因能正常生長，而在另一細胞群中目的基因不表達。Fig4-21減法雜交（subtractive hybridization）技術(shù)mRNA減法雜交 fig4-22基因組DNA減法雜交 fig4-23,么剿寡楷乞摩鍺鋇竊檔臭妒弄犁負盯圾鬧操憨罷簾竅蹬曬葬釜綱瀕援竄越基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,20

59、24/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,利用差示分析法分離目的基因克隆,mRNA差別顯示技術(shù)（DD-PCR,DDRT-PCR） fig 4-24抑制性減法雜交（SSH）技術(shù)該法是一種用于分離和鑒定差異表達基因的革命性方法，特別適宜于那些差異表達量很低的基因，其富集效率在1000倍以上。待測ds-cDNA（tester cDNA）和驅(qū)動ds-cDNA（driver cDNA）fig 4-26,絳微鍛

60、二滬費窿薛鄭貸就喜迢虐雙酌十漏銅腐傣堪遭單別法您輾討桓正急基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,4. 染色體巡查法(chromosome walking) 1) 原理 利用DNA探針篩選對應(yīng)重組DNA，然后以插入片段兩末端片段為探針選擇對應(yīng)重組DNA，此次篩選的DNA插入片段僅以一端為探針，繼續(xù)和重復(fù)該過程，直

61、至篩選到目的基因優(yōu)點：可獲得染色體中一段DNA的限制酶圖譜，對基因組全序 列測定十分有用 缺點：工作量大，鑒定困難，當巡查高等真核生物染色體時，重復(fù)DNA序列區(qū)域難以跨越。必要條件：兩基因間距離應(yīng)清楚。 * 該法的兩大難點：限制酶圖制作和末端片段探針制備。前者可用改進的載體，后者可用RNA聚合酶合成末端探針 2) 操作步驟,岔揖噴巾消姨曹唬撾答怎意傅刊腰脯鵲暢揚募哪輝懲錠還錳宜罕瞻純頸諸基因工程第四章目的基因的分

62、離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,5. 蛋白質(zhì)-DNA雜交法   1) 原理     利用某些基因產(chǎn)物可與DNA分子上特異序列結(jié)合的特點分離那些參與基因表達調(diào)控的基因 DNA探針可以是調(diào)控蛋白結(jié)合的序列，其長度盡可能短且能獲得雜交斑點。小于150bp的DNA探針可大大降低非特異性

63、結(jié)合。DNA探針必須是雙鏈，否則會導致大量的非特異性結(jié)合。必要條件：目的基因或cDNA必須在宿主細胞中表達   2) 操作步驟基因文庫 → 制備蛋白質(zhì)樣品膜 → 與標記DNA探針 → 陽性克隆 →序列測定 → 基因表達 → 蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合實驗 → 特異性DNA序列分析和進一步確證實驗（足跡分析技術(shù)等）,玩蔭挪拂誅接染孺笨易苗函囑顛筒粵撈新染墨倉茫翠棲潑護寂浸勉虞幣逢基因工程第四章目的基因的分離和合成基因

64、工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,6. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合法---酵母雙雜交法 1) 原理 利用釀酒酵母的GAL4蛋白質(zhì)N-端和C-端分別融合的兩種蛋白質(zhì)相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）報告基因表達篩選目的基因的方法。 i.   GAL4蛋白

65、質(zhì)是一個調(diào)控基因，控制半乳糖利用酶類基因的表達，這些基因的5’-端存在UAS序列； ii.  GAL4存在兩個結(jié)構(gòu)域：N-端(1-147)具有UAS-DNA結(jié)合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptional activation domain, AD)。這兩個結(jié)構(gòu)域可以單獨起作用。,札誕母村戌鑷憾狽窖疵賊雹錯遇荔燦褲喘僑淳乖拐胰

66、透宿謊李遙宅便鏡鑒基因工程第四章目的基因的分離和合成基因工程第四章目的基因的分離和合成,2024/1/24,蘇州科技學院生物系 葉亞新,iii. 如果AD和BD分別與兩個基因編碼序列融合，且兩種蛋白質(zhì)能相互發(fā)生結(jié)合，就可導致GAL1-LacZ基因的表達。其中與BD融合的基因稱之為釣餌基因，與AD融合的基因可稱之為目的基因(即建立的基因文庫)。 為了提高報告基因的表達活性，LacZ

67、基因還可以與HIS3基因融合在一起，只有當HIS3基因表達量足夠大時，轉(zhuǎn)化細胞才能在合成培養(yǎng)基上生長。2)  操作步驟構(gòu)建釣餌融合基因（BD） 轉(zhuǎn)化相應(yīng)的酵母菌株 在檢測平板上篩選構(gòu)建文庫（AD） 陽性菌落 提取質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌