全國會議結(jié)石組發(fā)言2014

1、p38MAPK信號通路在草酸鈣腎結(jié)石形成中的作用研究,湖北省中醫(yī)院泌尿外科曾令啟,p38MAPK信號通路概述,絲裂原激活蛋白激酶（ MAPK，mitogen-activated protein kinase）是哺乳動物廣泛表達的蘇氨酸/絡(luò)氨酸激酶，具有雙重磷酸化能力ERK，JNK，P38MAPK主要功能：傳遞信號（細(xì)胞外 細(xì)胞內(nèi)）應(yīng)激刺激（UV、H2O2、熱休克、缺氧等）、炎性因子（TNF-α、IL-1、IL-18 、FG

2、F等 ）、LPS、G﹢細(xì)胞壁成分 p38激活 誘導(dǎo)保護蛋白質(zhì)合成 細(xì)胞周期（生長、凋亡、分化）,,四種亞型：α、β、γ、δp38MAPKα、β：幾乎在所有的組織中均有表達，調(diào)節(jié)細(xì)胞基本的生命活動，并且在應(yīng)激反應(yīng)中起主要作用p38MAPKγ：肺、胰腺、腎臟、睪丸和表皮組織p38MAPKδ：骨骼肌、心臟和胸腺中含量豐富，控細(xì)胞的糖代謝。,,p38MAPK通路阻斷：吡咯咪唑類化合物， SB206718、SB2

3、20025、SB202190、SB203580、 B239063、VKl99等 p38MAPK與疾?。?炎癥（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、）；心血管疾?。ㄐ募〖?xì)胞功能障礙，缺血再灌注損）；腫瘤；神經(jīng)退行性疾病（ Alzheimer’s disease、Huntington’s disease、 Parkinson’S disease、multiple sclerosis、 amyotrophic lateral sc

4、lerosis ）；糖尿?。谎鄄考膊。患毙苑嗡[；疼痛（前列腺炎等）。,經(jīng)Ras蛋白活化絲裂原蛋白激酶,應(yīng)激因子 細(xì)胞G0轉(zhuǎn)入G1期 活化受體TPK

5、 調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯 Ras—GDP Ras—GTP(有活性) 活化Raf(具MAPKKK活性) 催化c-jun,c-fos,c-myc磷酸化

6、 MAPKK磷酸化 MAPK磷酸化,,,,,,,,,,COM結(jié)晶與腎小管上皮細(xì)胞相互作用,細(xì)胞損傷：產(chǎn)生ROS、誘發(fā)脂質(zhì)過氧化及炎癥因子（IL-6、MPC-1）晶體粘附和滯留：通過大分子物質(zhì)之間的識別迅速而牢固地粘附于上皮細(xì)胞膜發(fā)生滯留啟動

7、結(jié)石形成的級聯(lián)反應(yīng)細(xì)胞攝入晶體：腎小管上皮細(xì)胞主動攝入晶體細(xì)胞內(nèi)事件：一些細(xì)胞死亡，一些細(xì)胞基因激活而增殖，或促進細(xì)胞產(chǎn)生大分子物質(zhì)來調(diào)節(jié)結(jié)石的形成細(xì)胞間質(zhì)鈣化：加劇細(xì)胞毒性，誘發(fā)炎癥和壞死,COM結(jié)晶激活p38MAPK信號通路的研究,目的：探索草酸鈣腎結(jié)石形成過程中p38MAPK的作用,實驗方法,人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）細(xì)胞在各個時間點（0~30min）暴露于一水草酸（COM）結(jié)晶（20μg/cm2 ）暴露于DME

8、M作為陰性對照，暴露于茴香霉素（10μg/ml）30min作為陽性對照Western Blot檢測磷酸化p38MAPK和總p38MAPK（磷酸化/去磷酸化）的活性觀察通過使用肝素特異性地抑制COM結(jié)晶與HK-2細(xì)胞的結(jié)合而阻滯p38MAPK的激活觀察通過使用SB203580對p38MAPK特異性的抑制而消除COM結(jié)晶誘導(dǎo)的DNA合成,結(jié) 果,一、COM結(jié)晶誘導(dǎo)p38MAPK的活性：1.細(xì)胞暴露于COM結(jié)晶逐漸誘導(dǎo)磷酸化p38

9、MAPK的免疫活性，p38MAPK的最大激活發(fā)生在COM結(jié)晶暴露15min，磷酸化p38 MAPK的免疫活性平均增加為超過對照組的4.6倍,,時間(min) 0 5 15 30 30COM - + + + -茴香霉素 - - -

10、- +圖1. COM結(jié)晶和茴香霉素在不同時間誘導(dǎo)磷酸化p38 MAPK的免疫活性,時間(min) 0 5 15 30 30COM - + + + -茴香霉素 - - - - +圖2.密度計定量分析磷酸化p38 MAPK的免疫活

11、性水平 注：p＜0.001（草酸組 vs 對照組，15min） p＜0.01（茴香霉素組 vs 對照組30min）,,2.用抗總p38MAPK的抗體進行Western Blot，COM結(jié)晶的暴露并不能改變p38 MAPK蛋白質(zhì)的總量。 時間(min) 0 5 15 30 30

12、 COM - + + + - 茴香霉素 - - - - +圖3.Western Blot顯示p38 MAPK蛋白質(zhì)總量,,二、COM

13、結(jié)晶誘導(dǎo)p38MAPK的激活作用需要COM結(jié)晶與腎 上皮細(xì)胞的結(jié)合： 1.肝素（50、100μg/ml）暴露于HK-2細(xì)胞抑制COM結(jié)晶與HK-2細(xì)胞 結(jié)合 COM + + + 肝素(μg/ml)

14、 - 50 100圖4.肝素對COM結(jié)晶與HK-2細(xì)胞結(jié)合的抑制作用,,2.肝素抑制COM結(jié)晶刺激的p38MAPK的磷酸化作用和p38MAPK的活性（圖5，圖6）, 但是肝素（50、100μg/ml）對COM結(jié)晶與HK-2細(xì)胞結(jié)合的抑制作用對總p38 MAPK的蛋白質(zhì)總量沒有影響（圖7）。 COM

15、- + + + 肝素(μg/ml) - - 50 100 圖5. Western Blot顯示肝素抑制COM結(jié)晶誘導(dǎo)的p38MAPK的磷酸化作用,,COM - + + +

16、 肝素(μg/ml) - - 50 100圖6. Western Blot顯示肝素抑制COM 結(jié)晶誘導(dǎo)的總p38MAPK的活性,COM - + + + 肝素(μg/ml) - - 50 100圖7. Western Blot顯示肝素對總p38MAPK的蛋白質(zhì)總量沒有

17、影響,,三、COM結(jié)晶誘導(dǎo)的DNA合成1. HK-2細(xì)胞暴露于COM結(jié)晶導(dǎo)致DNA合成的再啟動。COM結(jié)晶誘導(dǎo)DNA合成在一定的范圍內(nèi)（2～100μg/cm2、10～500μg/ml）是一種劑量依賴性的關(guān)系如圖8。在20μg/cm2 --100μg/ml的COM結(jié)晶暴露觀察到明顯的刺激刺激作用，超過對照組2倍多（p<0.01） COM結(jié)晶 0 2 4 10

18、20 40 80 100圖8. COM結(jié)晶誘導(dǎo)的DNA合成作用，超過對照組2倍多（p<0.01）,,四、SB203580抑制COM結(jié)晶誘導(dǎo)的DNA合成： 在SB203580缺乏或者其濃度逐漸增加的條件下，HK-2細(xì)胞在各時間點（0～24h）暴露于COM結(jié)晶（20μg/cm2）。暴露于COM結(jié)晶導(dǎo)致DNA合成超過對照組2倍。用SB203580以一種劑量依賴性方式抑制COM結(jié)晶誘導(dǎo)的DNA合成，在20μ

19、mol/L時完全抑制。 SB203580(μmol/L)0 0 1 5 10 20 30 50 100 COM （20μg/cm2 )- + + + + + + + +圖10. SB203580抑制COM結(jié)晶誘導(dǎo)的DNA合成,結(jié) 論,COM結(jié)晶與