原料藥中雜質的控制與案例分析

1、原料藥中雜質的控制與案例分析,中國藥品生物制品檢定所胡昌勤,雜質質控理念的變遷,Impurity Profile （雜質譜）: A description of the identified and unidentified impurities present in a drug substance. 對存在于藥品中所有已知雜質和未知雜質的總的描述。,第一次飛躍,第二次飛躍,,,頭孢泊肟酯有關物質分析的HPLC色譜圖1=頭孢泊肟

2、，2=去甲氧基頭孢泊肟酯異構體A，3=頭孢泊肟酯異構體A，4=去甲氧基頭孢泊肟酯異構體B+△3異構體，5=頭孢泊肟酯異構體B+反式頭孢泊肟酯A，6=反式頭孢泊肟酯B，7=N-甲?；^孢泊肟酯異構體A，8=NAC-CPOD-PRX異構體A，9=N-甲?；^孢泊肟酯異構體B，10=N-乙?；^孢泊肟酯異構體B，11=頭孢泊肟酯開環(huán)二聚體A，12=頭孢泊肟酯開環(huán)二聚體B,雜質譜控制與雜質控制的區(qū)別？,雜質譜控制的整體解決方案,原料藥雜質控制

3、的相關法規(guī),Q3A： 新原料藥中的雜質Q3B： 新藥制劑中的雜質Q3C： 殘留溶劑化學藥品雜質研究的技術指導原則,對新原料藥中的雜質如何進行闡述？,化學方面分類與鑒定報告雜質的控制（檢查項目、限度）分析方法安全性方面對安全性研究及臨床研究中存在的潛在雜質（在當時的實驗樣品中不存在或含量極低的雜質）的安全性評估,雜質的分類,有機雜質反應起始物、副產物、中間體、降解產物、試劑、配位體、催化劑等無機雜質試劑、配位體、

4、催化劑、重金屬、無機鹽及過濾介質、活性炭等殘留溶劑常用的有69種,基本術語,Qualification(界定)：是獲得和評價與研發(fā)新藥相關的雜質的數據的過程，這些數據用于建立新藥的安全閾值（水平），單個的或一些已確定的雜質的含量在這個閾值下可以確保藥品的生物安全性。Reporting threshold 或 Reporting level (報告閾值或報告水平）：新藥注冊時雜質應被報告的限度。Identified thresho

5、ld (鑒別閾值）：新藥注冊時雜質應被鑒別的限度。Qualificated threshold (界定閾值）：新藥注冊時雜質應被界定的限度。,新藥原料藥的雜質限度,,（以原料藥的響應因子計）,如何合理的對原料藥中的雜質進行報告和控制？,研究報告中對有機雜質的基本要求,對新原料藥在合成、精制和儲存過程中最可能產生的那些實際存在的雜質和潛在的雜質進行綜述。根據合成工藝中化學反應的原理，結合反應條件等，闡述合成工藝中可能產生的副產物；根

6、據起始原料的結構及來源，闡述可能由起始原料引入的有關物質；根據起始原料、中間體、產物的結構特點，產生合成中可能產生的降解產物；根據產物及雜質的結構特點，結合純化精制工藝，闡述去除雜質的關鍵工藝。,頭孢噻肟鈉（Cefotaxime Sodium）雜質的控制,以頭孢菌素C為起始物，先經化學或酶催化反應生成7-氨基頭孢烯酸（7-ACA），然后進行?；磻深^孢噻肟酸（CTAX），最后生成頭孢噻肟鈉（CTAX-Na）。,頭孢菌素的各種可能

7、的降解反應類型,?-內酰胺環(huán)的降解 氫化噻嗪環(huán)的雙鍵異構（Δ-異構）,,,,3. 6、7位氫的反向異構,,,4. 7位碳相連的側鏈反應,,分子結構中7位碳側鏈上有α-氨基的頭孢菌素，如頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢拉定、頭孢來星、頭孢克羅等藥物，還可發(fā)生分子內親核反應，生成哌嗪二酮衍生物的降解物,,具有苯苷氨酸側鏈的?-內酰胺抗生素可以降解為2-羥基-3-苯基吡嗪衍生物，這種化合物具有熒光特性，頭孢克洛、氯碳頭孢均會產生這種降

8、解產物。,,5. 發(fā)生在R3取代基的反應,,當3位碳上的取代基為乙酰氧甲基時，易脫去乙?；?，形成脫乙?；到馕?。在加熱、酸性等條件下，可進一步進行分子內部環(huán)和，此時生成的主要降解產物為內酯。,,6. 雙鍵順反式異構（E-異構）7. 酯的水解 8. 聚合反應9. 其它反應,頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢它啶、頭孢地尼等有甲氧亞氨鍵的頭孢菌素均會產生E-異構體，多數在光照的情況易發(fā)生此類反應。,基于降解反應的雜質分析,發(fā)生在頭孢菌素

9、R3取代基的降解反應,,當3位碳上的取代基為乙酰氧甲基時，易脫去乙?；?，形成脫乙?；到馕铩Ｔ诩訜?、酸性等條件下，可進一步進行分子內部環(huán)和，此時生成的主要降解產物為內酯。 雜質B、雜質E可以源于頭孢噻肟的降解,雜質譜分析,頭孢噻肟有關物質分子結構,頭孢噻肟鈉的合成工藝,,由于起始物頭孢菌素C含有DAO-CC、DA-CC和CC-LT等雜質，在半合成步驟中發(fā)生相同的反應，分別生成DAO-ACA、DA-ACA和ACA-LT，進而生成DAO-

10、CTAX、DA-CTAX和CTAX-LT等雜質。,雜質E可以源于起始原料雜質E可以源于合成中的任一中間過程,雜質譜分析,頭孢噻肟有關物質典型色譜圖（235nm）,雜質譜分析,頭孢噻肟有關物質雜質B含量最大，雜質C含量最低合成副產物：雜質A、雜質E和雜質G降解雜質：雜質F,,,生產工藝中產生的雜質,,闡述清楚產品中可能存在那些雜質雜質的來源生產工藝中通過何種手段去除或控制這些雜質的產生實際產品中這些的雜質水平及變化,加替沙

11、星及其十種雜質對照品的色譜圖,加替沙星注射液雜質譜分析,色譜條件：以三乙胺磷酸溶液 [三乙胺溶液（1→100），用磷酸調節(jié)pH值至4.3±0.05]-乙腈（87：13）為流動相，檢測波長為325nm，柱溫為30℃，流速為每分鐘1ml。,色譜柱:SHISEIDO CAPCELL PAK C18,加替沙星及10個已知雜質的結構式,主要雜質是雜質3和雜質8,,生產工藝雜質,原料的雜質譜分析,,,光照穩(wěn)定性評價,比較光照前后各雜質含量

12、的變化,按隨機取19批樣品,UV燈下照射10天,雜質2、雜質4是與光照穩(wěn)定性密切相關的雜質,,,大多數喹喏酮類抗生素對光不穩(wěn)定，什么是光降解雜質？,如何合理的對原料藥中的雜質進行報告和控制？,依據合成/降解反應機理，鑒別可能雜質！全過程跟蹤雜質在合成工藝中的變化！,雜質控制方法,直接測定色譜法HPLCTLCHPCEGC間接測定溶液的顏色檢查,雜質分析方法的選擇,方法互補原則了解不同方法間的相關性所有的分析方法必須進行

13、驗證（validation),藥品質控RP-HPLC方法,上市后（仿制）藥品分析方法的有效性分析方法的最優(yōu)化分析方法的耐用性新藥研發(fā)如何確定分離對象,所有的雜質在所選擇的RP-HPLC系統(tǒng)中被有效的檢出了嗎？是否有雜質吸附到色譜柱上未被洗脫？是否有雜質在色譜柱上未被保留？是否所檢測到的色譜峰存在共出峰？,新方法,分析方法的有效性（氨芐西林鈉/舒巴坦鈉）,原方法,中國抗生素雜志，2009，34：734,在對各國藥典方法比較

14、的基礎上確定分析方法,所有的雜質在所選擇的RP-HPLC系統(tǒng)中被有效的檢出了嗎？是否有雜質吸附到色譜柱上未被洗脫？是否有雜質在色譜柱上未被保留？是否所檢測到的色譜峰存在共出峰？,,采用HPCE/HPTLC方法驗證RP-HPLC方法的有效性,HPCE分析?-內酰胺抗生素雜質譜最佳分離模式的選擇,JCPS，2010，19（4）：285–292,頭孢菌素有關物質測定中MEKC是HPLC分析的最有效驗證方法,MEKC與HPLC測定頭孢

15、菌素有關物質的互補性分析,MEKC具有較強的雜質分離能力，但其檢測限（LOD）較高。借助于加速實驗，將MEKC分離出的雜質峰數目與HPLC分離出的含量大于MEKC LOD的雜質峰數目進行比較，當兩者基本相對時，可以認為HPLC方法具有較滿意的分離能力。,藥物分析雜志，待發(fā)表,HPLC與HPTLC分析慶大霉素的比較,HPTLC中的9號和10號斑點在HPLC中被檢出了嗎？,慶大霉素供試品HPTLC色譜圖及對應的UV掃描圖譜1.UK1

16、2.UK2 3.UK3 4.UK4 5.C1a 6.UK5 7.C2a+C2 8.C1,,,藥品質控RP-HPLC方法,上市后（仿制）藥品分析方法的有效性分析方法的最優(yōu)化分析方法的耐用性新藥研發(fā)如何確定分離對象,基于實驗設計理念的HPLC方法優(yōu)化理論,JPBA，2009, 49(5): 1192–1202,洛伐他定和辛伐他定有關物質HPLC分析方法的優(yōu)化,,,,新優(yōu)化出的方法比USP的分離度更好，比EP分離出的雜質峰更多，比

17、ChP所用的分離時間更短，并達到了更好的分離效果,藥品質控RP-HPLC方法,上市后（仿制）藥品分析方法的有效性分析方法的最優(yōu)化分析方法的耐用性新藥研發(fā)如何確定分離對象,基于QbD理念的雜質控制策略,JPBA，2008, 46(3):431-441,藥物雜質的可能來源,阿奇霉素的合成途經,1.原料：紅霉素 A、紅霉素 B、紅霉素 C、紅霉素D、紅霉素 E、紅霉素 F、阿奇霉素B、阿奇霉素C、阿奇霉素E、阿奇霉素F2.中間

18、體：紅霉素A肟（Z）、6，9-亞胺醚、氮紅霉素A、紅霉素A肟（E）、紅霉素 C肟（E）、9，11-亞胺醚、紅霉素C 6，9-亞胺醚、紅霉素A內酰胺 3.副產物：紅霉素-N-氧化物、N-去甲基紅霉素A、N-去甲基阿奇霉素A、氨基阿奇霉素A、N-甲?；?N去甲基阿奇霉素A、N-去甲基-N-苯磺?；⑵婷顾亍⑵婷顾豊-氧化物、3’-去（二甲氨基）- 3’,4’-去氫阿奇霉素、 O-甲苯磺?；t霉

19、素肟、紅霉素Z肟重排物、氮紅霉素11，12-硼酸酯、 N，N-去二甲基N-甲?；⑵婷顾谹、丙基阿奇霉素、3’-N， N-去二甲基氨基-酮基阿奇霉素A、阿奇霉素11，12-硼酸酯4.降解產物：去克拉克定糖阿奇霉素A、去克拉克定糖氮紅霉素、紅霉素8， 9-脫水-6，9-半縮酮、紅霉素6，9：9，12-螺縮酮,阿奇霉素中可能存在的雜質：37種,模擬色譜圖,實際色譜圖,采用有效的方法證明雜質不存在，而不是陳述雜質不存在！,?-內酰

20、胺抗生素聚合物的控制,SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)典型分離圖,樣品,對照,,Kav=0,高效凝膠色譜系統(tǒng),TSK高效凝膠色譜系統(tǒng)Superdex pipted 高效凝膠色譜系統(tǒng)高效疏水凝膠色譜系統(tǒng),高效疏水凝膠色譜系統(tǒng),TSK Gel G2500 HXL凝膠柱（填充劑為苯乙烯－二乙烯基苯共聚物）300×7.8mm i.d;流動相:含0.26％溴化鋰的N,N-二甲基甲酰胺溶液；流速0.4ml/min;檢測波長為

21、280nm。,?-內酰胺抗生素聚合物雜質分析,頭孢地嗪鈉,頭孢呋辛酯,TSKgel G2000HHR,頭孢丙烯,TSKgel G2500PWXL,法羅培南,TSKgel G2000HHR,TSKgel G2000SWXL,TSKgel G2000SWXL,Sephadex G10 與TSK柱比較,,62,G10柱結果與TSK柱結果的相關性,,Sephadex G10,TSK,聚合物,其他聚合物,,,,二聚物,,頭孢噻肟鈉聚合物分析,HP

22、LC反相色譜系統(tǒng)控制高分子雜質,通過對指針性雜質的測定，表征藥品中高分子雜質總量。,,頭孢泊肟酯有關物質分析的HPLC色譜圖1=頭孢泊肟，2=去甲氧基頭孢泊肟酯異構體A，3=頭孢泊肟酯異構體A，4=去甲氧基頭孢泊肟酯異構體B+△3異構體，5=頭孢泊肟酯異構體B+反式頭孢泊肟酯A，6=反式頭孢泊肟酯B，7=N-甲酰基頭孢泊肟酯異構體A，8=NAC-CPOD-PRX異構體A，9=N-甲酰基頭孢泊肟酯異構體B，10=N-乙?；^孢泊肟酯異

23、構體B，11=頭孢泊肟酯開環(huán)二聚體A，12=頭孢泊肟酯開環(huán)二聚體B,（A）阿莫西林鈉在Superdex Peptide高效凝膠色譜系統(tǒng)中的色譜圖 （B）各色譜峰切換到BP有關物質HPLC分析系統(tǒng)后的色譜圖,中國新藥雜志 ,2008,17(24):23,,在溶液中（阿莫西林鈉易形成聚合物），阿莫西林閉環(huán)二聚體和二酮哌嗪阿莫西林（2－S）的含量與各類阿莫西林聚合物含量之和（主峰后雜質總量）呈一定的相關性,中國藥學雜志, 2009，44（2

24、3）：1821,,柱切換技術,,,反沖模式(Back flushing mode),柱前富集模式(on-column focusing),鹽酸頭孢替安聚合物分析方法的比較,,,,Sephadex G-10系統(tǒng),TSK-Gel G2000swxl系統(tǒng),,柱切換技術,0.8ml/min,TSK系統(tǒng)0.5ml/min,C18系統(tǒng),,對?-內酰胺抗生素中的聚合物重點在于研究，證明所采用的工藝是否可能導致樣品聚合物變化！應采用適宜的方法對?-

25、內酰胺抗生素中的聚合物進行控制，而不要僅局限于Sephadex G10系統(tǒng)！,,樣品中雜質含量的報告,批次及批量生產日期生產地點生產工藝產品中單個雜質含量及雜質總量批次用途使用的分析方法,,報告研制過程中所有批次樣品的檢驗結果；檢驗結果應用詳細記錄，而不是簡單描述為“符合規(guī)定”；分別記錄單個雜質（已知雜質、未知雜質）、總雜質的含量；所有的雜質應編號，如根據保留時間等小于1.0%的雜質，表示為兩位小數，如0.13%,

26、0.06%大于1.0%的雜質，表示為一位少數，如1.3％,在新藥研發(fā)過程中，采用統(tǒng)一的編號系統(tǒng)，表征雜質的變化！,,如果新藥研發(fā)過程中雜質分析方法改變，應分別給出其驗證資料并對不同方法的相關性進行評價。色譜圖的相關性比較是必須的。,,,利用色譜相關光譜法追蹤色譜峰不同色譜系統(tǒng)中的位置,,雜質數據的積累是制定藥品質量標準的重要依據,國內新藥研發(fā)中對有關物質控制的誤區(qū),重指標，輕方法方法的有效性與樣品的現狀對雜質結構的鑒別重視不夠,

27、如何確定微量雜質的結構？,根據雜質來源，產生條件，結合母核的質譜裂解規(guī)律推斷雜質的可能結構,頭孢菌素類抗生素質譜裂解的一般規(guī)律,青霉素類抗生素質譜裂解的一般規(guī)律,,鑒定未知同系物結構的策略－1,對于具有相同母核的化合物： 紫外光譜圖可以得到有關母核結構的信息； 一級質譜得到分子量信息； 二級質譜得到碎片峰信息,可以推測出有關各取代基的情況； 利用色譜保留行為來驗證推測結果是否正確。,ACA，535：89-99,

28、2005,分析化學，34（1）：95-99，2006,藥學學報，41（5）：475-480，2006,鑒定未知降解雜質結構的策略－2,對于反應機理已知的降解雜質： 根據反應原理設計加速實驗； 一級質譜得到分子量信息； 二級質譜得到碎片峰信息, 進一步推測降解物的結構； 利用UV特征和色譜保留行為來驗證推測結果是否正確。,確定未知雜質的策略－3,推測雜質的可能結構反合成推測的可能雜質LC/MS通過質譜裂解規(guī)律和

29、色譜保留時間確定所推測雜質結構的準確性,微量組分的毒性評價,,毒性快速評價平臺,斑馬魚毒性快速評價平臺，對雜質的胚胎毒性、神經毒性，心臟毒性等進行評價。優(yōu)點：雜質用量少無需知道雜質結構實驗周期短（3－4天一個周期）,Figure 4. Effects of MMTD and TDA on the zebrafish embryonic development (3-dpf). A-D: The embryos treat

30、ed with MMTD at 10 ?g/ml (A), 100 ?g/ml (B), 300 ?g/ml (C) and at 500 ?g/ml (D). E-H: the embryos treated with TDA at 100 ?g/ml (E,F), 300 ?g/ml (G) and at 500 ?g/ml (H); I,J: normal embryos as controls at a lateral view

31、 (I) and a dorsal view (J). Hemorrhage of brain areas is indicated by white arrow, opaque yolk and YE by red arrow, deficient eyes are by slight-blue arrows, colorless and cord-like hearts and enlarged pericardial sacs b

32、y yellow arrows, ripple-like notochords by orange arrows.,雌二醇對斑馬魚胚胎的心臟毒性,斑馬魚作為藥物耳毒性檢測模型,斑馬魚側線神經丘毛細胞:,(A) 5－dpf 幼體頭部側面，示 眼窩上 (SO1 and SO2), 耳囊(O1) 和枕部的 (OC1)的神經丘；(B) O1神經丘毛細胞雙染色－FM 1-43(紅) 和 Yo-Pro-1 (綠). (C) FM 1-43染色； (

33、D). Yo-Pro-1 染色。 Scale bar = 50 um (A); 10 um (B–D).,Hearing Research 213 (2006) 25–33,,藥物耳毒性檢測利用一種特殊染料對斑馬魚幼體頭部耳蝸區(qū)神經丘毛細胞的染色，檢測毛細胞的存活狀態(tài)，來判斷檢測物的耳毒性。下圖中紅色圈示耳蝸區(qū)域；給藥組中紅色箭頭示給藥后毛細胞減少，黃色圈示給藥后1神經丘消失。,給藥后,,,系統(tǒng)對照組（正常幼體）,,雜質安全性的界定

34、（評估）,,申報者應對所制定的質量標準中的雜質限度提供安全性方面的理由。對于一個通過充分的安全性研究和臨床研究的新原料藥，其中任何一個雜質的水平被認為是已經經過評價的；對于與動物和/或人體內的重要代謝物結構相同的雜質，被認為是經過評價的；雜質的實際含量如果低于雜質的界定閾值，也被認為是合理的。,對結構已知但含量大于界定限的雜質；結構未知且含量大于鑒別限的雜質，如對雜質的安全性不確定，均需要對雜質進行界定。,,,頭孢西酮鈉雜質限

35、度的評估,頭孢西酮鈉雜質限度定為“MMTD不得過1.0%，其它最大雜質不得過2.0%，雜質總量不得過4.0％”。,如何對雜質限度進行評估？,頭孢西酮的主要降解雜質？頭孢西酮的主要毒性功能基團？頭孢西酮的主要毒性雜質？,頭孢西酮鈉毒性功能基團分析,MMTD結構是頭孢西酮的主要毒性功能基團,頭孢西酮鈉的毒性反應與頭孢唑林鈉相當,其在斑馬魚胚胎發(fā)育中表現出的畸形與母環(huán)7-ACA及三位側鏈結構無關，與MMTD的結構關系較大。其畸形表型提示，

36、相關化合物可能主要干擾了胚胎的外胚層（神經系統(tǒng)和表皮色素）組織器官和中胚層的心腦血管系統(tǒng)的發(fā)育。,頭孢西酮鈉降解溶液的HPLC色譜圖,,①頭孢西酮的氧化產物主要有兩個氧化降解雜質，其RRT分別為0.572和0.672，含量以頭孢西酮計分別為1.75％、6.27％；與降解前樣品比較，頭孢西酮含量約為降解前的80％。②頭孢西酮的酸降解產物主要有一個工藝&降解雜質和一個降解雜質，其RRT分別為0.253和0.326，含量以頭孢西酮計

37、分別為0.29％、0.42％；與降解前樣品比較，頭孢西酮含量約為降解前的90％。③頭孢西酮的堿降解產物較多，主要有1個工藝&降解雜質和4個降解雜質，它們的RRT分別為0.186、0.244(?頭孢西酮酸)、0.725(MMTD)、0.913、1.172，含量以頭孢西酮計分別為0.86％、9.27％、4.15％、1.01％、10.07％；與降解前樣品比較，頭孢西酮含量約為降解前的70％。,MMTD是主要毒性雜質,,頭孢西酮鈉雜質

38、限度的評估,頭孢西酮鈉的毒性反應與頭孢唑林鈉相當,其在斑馬魚胚胎發(fā)育中表現出的畸形與母環(huán)7-ACA及三位側鏈結構無關，與MMTD的結構關系較大。其畸形表型提示，相關化合物可能主要干擾了胚胎的外胚層（神經系統(tǒng)和表皮色素）組織器官和中胚層的心腦血管系統(tǒng)的發(fā)育。 MMTD是頭孢西酮鈉的主要降解毒性雜質，其致畸毒性較頭孢西酮大10－20倍，如將其含量控制在1％以下，毒性作用基本可以忽略。BP中，頭孢唑林鈉的雜質E就是MMTD，其限量也是1％。