梅毒檢測(cè)技術(shù)及進(jìn)展

1、梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)及進(jìn)展,,梅毒概述實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)及臨床意義梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略探討,主要內(nèi)容,梅毒概述,梅毒起源于美洲，然后從美洲到西班牙，從歐洲到亞洲印度，1505年從印度傳入廣東嶺南（“廣東瘡”），后傳到全國(guó)各地。,少數(shù)民族地區(qū)居民梅毒感染率 = 10%牧區(qū)人群梅毒感染率 = 48%部分城市地區(qū)人群梅毒感染率 = 5%部分農(nóng)村地區(qū)人群梅毒感染率 = 2-3%（此幻燈片內(nèi)容源自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心陳祥生教授

2、）,我國(guó)梅毒流行的歷史-經(jīng)濟(jì)繁榮的附帶品,5,,1350萬(wàn),,我國(guó)根據(jù)2011年全國(guó)HIV哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)患病率結(jié)果進(jìn)行初步估計(jì)：,我國(guó)梅毒疾病負(fù)擔(dān)占全球的比重？,我國(guó)占全球8%，亞太地區(qū)22%，是西太區(qū)平均水平的2倍,STD epi & control - Chen XS,我國(guó)梅毒報(bào)告疫情趨勢(shì),隱性梅毒,一期梅毒,二期梅毒,胎傳梅毒,三期梅毒,7,梅毒報(bào)告病例數(shù)444,952例，甲乙類傳染病第3位淋病報(bào)告病例數(shù)103,085例，甲乙

3、類傳染病第6位,2013年全國(guó)梅毒、淋病病例報(bào)告,8,2011年全國(guó)HIV哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)資料(NCAIDS),我國(guó)的梅毒在哪里？,9,重點(diǎn)人群中的梅毒高危人群？,10,我國(guó)預(yù)防與控制梅毒規(guī)劃,衛(wèi)生部2010年6月下發(fā)《中國(guó)預(yù)防與控制梅毒規(guī)劃（2010-2020年）》,STD epi & control - Chen XS,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)及臨床意義,下列說(shuō)法是否正確？,二期梅毒時(shí)，TPPA和RPR兩種血清學(xué)試驗(yàn)100％陽(yáng)性RPR只能用

4、于梅毒初篩RPR滴度應(yīng)在1：8以上才能作為診斷隱性梅毒，梅毒血液標(biāo)本的核酸檢測(cè)陰性，表明無(wú)梅毒螺旋體感染接受抗梅治療的嬰兒，隨訪18個(gè)月后TPPA試驗(yàn)陽(yáng)性，RPR試驗(yàn)陰性可確診為胎傳梅毒----,12,常用梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,病原學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè),病原學(xué)檢查,原理：一期、二期梅毒時(shí)，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從

5、而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行檢測(cè)。方法：（1）暗視顯微鏡檢查 （2）鍍銀染色法 （3）核酸檢測(cè)（血液標(biāo)本？）注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒(méi)有獲得成功，僅能通過(guò)接種兔睪丸等部位進(jìn)行有限增殖。,病原學(xué)檢查,不同標(biāo)本核酸檢測(cè)研究初步結(jié)果：皮損部位標(biāo)本：陽(yáng)性率85%血漿標(biāo)本陽(yáng)性率：0%全血標(biāo)本： 一期梅毒陽(yáng)性率：0%

6、二期梅毒陽(yáng)性率：36% 隱性梅毒陽(yáng)性率：20%：,,病原學(xué)檢查的臨床意義,螺旋體檢查是診斷早期梅毒的最佳方法，對(duì)于患者的早期診斷、及時(shí)治療、預(yù)后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。如未見(jiàn)到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。,梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法,(1) 非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) （非特異性梅毒抗體）(2) 梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) （特異性梅毒抗體）兩類方法。問(wèn)題：

7、為什么梅毒診斷需要上述兩類血清學(xué)檢測(cè)方法？,,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理,梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可對(duì)螺旋體表面的脂質(zhì)作出免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的非特異性抗體可長(zhǎng)期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉(zhuǎn)為陰性。問(wèn)題： 臨床上非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)為什么需要做定性和定量?jī)煞N檢測(cè)方法？,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)原理,方法包括： （1）快速血漿反應(yīng)素環(huán)

8、狀卡片試驗(yàn) (RPR) （2）甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST） （3）性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn) (VDRL)等?；境煞质切牧字?卵磷脂和膽固醇抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見(jiàn)上述方法的敏感性和特異性都基本相似,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理示意圖,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn),1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速？轉(zhuǎn)幅？,2、定性試驗(yàn)加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布

9、在整個(gè)圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號(hào)針頭加1滴抗原反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下觀察結(jié)果,？滴/mL，1滴=？ul,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn),1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)幅,2、定性試驗(yàn)加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布在整個(gè)圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號(hào)針頭加1滴抗原反應(yīng)：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下觀察結(jié)果,6

10、0滴/mL，1滴=17ul,100r/min約18mm,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)操作要點(diǎn),3、定量試驗(yàn)稀釋夜準(zhǔn)備：在反應(yīng)紙板圈內(nèi)加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開(kāi)加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個(gè)圈內(nèi)。 下同定性試驗(yàn)。,,,,,,,,,,,,,？,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,問(wèn)題：定量試驗(yàn)原倍血清滴度是多少？,問(wèn)題：定

11、量試驗(yàn)血清稀釋需要使用試管嗎？,TRUST 1:16,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果判斷,RPR 1:256,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,1:512,1:32,1:64,1:128,1:256,1:512,,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)臨床意義,早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后 一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性 二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性

12、。 晚期梅毒 治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽(yáng)性。,,非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)臨床意義,非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、快速、敏感性和特異性較好。適用于大量人群的篩查。因治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征。VDRL試驗(yàn)用于神經(jīng)梅毒腦脊液檢測(cè)特異性高，檢測(cè)陽(yáng)性可以作為神經(jīng)梅毒確診依據(jù)，但敏感性較低，即檢測(cè)陰性不能排除神經(jīng)梅毒。,,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)特點(diǎn),假陽(yáng)性反

13、應(yīng)技術(shù)性假陽(yáng)性反應(yīng)一般是由于操作錯(cuò)誤引起的假陽(yáng)性反應(yīng)，經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)即可排除。生物學(xué)假陽(yáng)性反應(yīng)(一般滴度小于1:8），應(yīng)采用梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)如TPPA等進(jìn)行排除。,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理,抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測(cè)梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)呈陽(yáng)性，則患者終身陽(yáng)性。問(wèn)題：梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)的定量試驗(yàn)在梅毒診療中有意義嗎？,梅毒螺

14、旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)方法,梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn) (TPPA) 梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn) (TPHA) 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測(cè) (RT) 熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（WB）,TPPA,TPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見(jiàn)的凝集反應(yīng)，具有較高的敏感性和特異性。 TP

15、PA是目前WHO公認(rèn)的梅毒抗原血清學(xué)試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用于新方法、新試劑的參照標(biāo)準(zhǔn)。,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,明膠顆粒,梅毒抗原,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,抗原致敏顆粒,抗原致敏顆粒,血液中抗體,抗原抗體凝集,TPPA試驗(yàn)原理示意圖,32,,4+： 粒子光滑覆蓋整個(gè)孔底，有時(shí)邊緣有折疊

16、3+： 粒子光滑覆蓋大部分底 2+：粒子光滑聚集覆蓋孔底，周圍有一細(xì)胞環(huán) 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周圍有一明顯細(xì)胞環(huán) ±： 粒子沉集孔底，中央形成一小點(diǎn) –： 粒子緊密沉積孔底中央,TPPA試驗(yàn)結(jié)果判讀,a:均為RPR陽(yáng)性標(biāo)本,ELISA/ CLIA,ELISA試驗(yàn)是用重組梅毒螺旋體抗原包被

17、固相板條，加上梅毒血清和單克隆抗體酶標(biāo)記物，形成抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記物結(jié)合，用酶聯(lián)檢測(cè)儀判定試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)。本法可用于大樣本血清檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光法的臨床應(yīng)用意義基本同ELISA化學(xué)發(fā)光法的敏感性？？,梅毒免疫層析快速檢測(cè)方法（全血法）,34,梅毒免疫層析快速檢測(cè)方法（血清、血漿法）,梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（WB）,熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）,梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)臨床意義,作為非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)(如RPR等)初

18、篩陽(yáng)性標(biāo)本的確證試驗(yàn)，排除RPR 假陽(yáng)性。不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行診斷。梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)不能作為療效觀察的指標(biāo)。,非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)結(jié)果解釋示意圖,,,,,,,,,,,,,,,,早期,晚期,一期,二期,早期潛伏,,,,晚期潛伏,三期,治療前 治療后,陽(yáng)性,陰性,梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)結(jié)果解釋示意圖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,早期,一期,,二期,早期潛

19、伏,,晚期,,晚期潛伏,,三期,,治療前 治療后,陽(yáng)性,陰性,梅毒血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果解釋（梅毒臨床診斷參考依據(jù)）,41,問(wèn)題：此結(jié)果解釋適用于先天（胎傳）梅毒嗎？,先天（胎傳）梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù),查到螺旋體其抗心磷脂抗體滴度持續(xù)上升其抗心磷脂抗體滴度高于其母親四倍（2個(gè)稀釋滴度）檢測(cè)抗梅毒的IgM特異性抗體陽(yáng)性隨訪18個(gè)月觀察抗體的變化（哪一類抗體？） 《預(yù)防艾滋病、梅毒和乙肝母嬰傳播工作實(shí)施方案》,

20、問(wèn)題：IgG抗體和IgM抗體有什么區(qū)別？,梅毒IgM抗體（TP-IgM）,IgM抗體的產(chǎn)生是感染后的早期體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。IgM分子比IgG較大，所以IgM抗體不能通過(guò)胎盤屏障。而母親的IgG抗體可以通過(guò)胎盤屏障傳給胎兒。因此若在新生兒血中檢測(cè)到IgG抗體不能作為先天梅毒的診斷依據(jù)，而IgM抗體可為先天梅毒的診斷依據(jù)。 IgM抗體檢測(cè)其特異性較高，但敏感性較低。因此，IgM抗體檢測(cè)陰性，不能排除先天梅毒感染。,4

21、3,先天（胎傳）梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù),查到螺旋體其抗心磷脂抗體滴度持續(xù)上升其抗心磷脂抗體滴度高于其母親四倍（2個(gè)稀釋滴度）檢測(cè)抗梅毒的IgM特異性抗體陽(yáng)性隨訪18個(gè)月觀察抗體的變化（特異性抗體）,梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略探討,梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略思考,,,46,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn),梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn),,排除試驗(yàn)假陽(yáng)性確證梅毒螺旋體現(xiàn)癥感染,,排除治愈的既往感染者確證梅毒螺旋體現(xiàn)癥感染,？RPR：初篩試驗(yàn) TPPA

22、：確證試驗(yàn),梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略思考,方法選擇依據(jù)敏感性、特異性（試劑評(píng)估）操作流程（可及性）試劑的價(jià)格、結(jié)果時(shí)間（可接收性）,47,？初篩目的和方法選擇,規(guī)范化梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求,根據(jù)目的選擇檢測(cè)方法及檢測(cè)策略?？刹捎萌魏我活惷范狙鍖W(xué)檢測(cè)方法作為篩查試驗(yàn)。,49,血清學(xué)檢測(cè)試劑的種類,50,,,,51,陽(yáng)性,,,下列說(shuō)法是否正確？,二期梅毒時(shí)，TPPA和RPR兩種血清學(xué)試驗(yàn)100％陽(yáng)性RPR只能用于梅毒初篩RPR滴度應(yīng)在1