hplc使用須知

1、HPLC 使用須知,劉揚(yáng)中 實(shí)驗(yàn)室2009.09.12,內(nèi)容簡(jiǎn)要,I HPLC儀器簡(jiǎn)介II HPLC 的使用及注意事項(xiàng)Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù)IV 錯(cuò)誤實(shí)例,,高效液相色譜 (High performance Liquid Chromatography) -----儀器簡(jiǎn)介,,易學(xué)難用,,,,UV檢測(cè)設(shè)備,,,色譜柱,,進(jìn)樣閥,HPLC儀器簡(jiǎn)介,,,,HPLC儀器簡(jiǎn)介,BCAD,,HPLC儀器簡(jiǎn)介,,Agi

2、lent 1100 手動(dòng)進(jìn)樣器工作原理,HPLC儀器簡(jiǎn)介,,,Ⅱ HPLC 使用及注意事項(xiàng),樣品的準(zhǔn)備流動(dòng)相的準(zhǔn)備開(kāi)機(jī)前的準(zhǔn)備進(jìn)樣前的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)束,基本原則： 避免由人為因素引起的系統(tǒng)或柱子損傷,源頭： 樣品流動(dòng)相儀器操作,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簶悠方?jīng)過(guò)色譜柱達(dá)到分離分析的目的,一、 樣品的準(zhǔn)備,溶解樣品的溶劑選擇,與流動(dòng)相 相溶 有機(jī)流動(dòng)相： 盡量避免NaCl、磷酸緩沖鹽，

3、TEAA較好。如果不確定，可以先實(shí)驗(yàn)溶劑與流動(dòng)相的相溶性。在固定相上可保留（針對(duì)進(jìn)樣體積較大時(shí)）離子交換柱：不用高鹽溶劑反相柱：不用純有機(jī)溶劑適當(dāng)?shù)膒H 值,最好使用流動(dòng)相溶解樣品,一、 樣品的準(zhǔn)備,樣品溶液除雜質(zhì),離心沉淀懸浮物（可能看不見(jiàn)） 10min 12K （注意：離心管會(huì)發(fā)熱) 。如果有沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中過(guò)濾（針對(duì)進(jìn)樣體積較大時(shí)）水溶液：0.22 ?

4、m 濾膜過(guò)濾 （1、5、10ml注射器） 4°久置的多肽和DNA樣品；分離制備樣品使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。,二、 流動(dòng)相的準(zhǔn)備,流動(dòng)相選擇,液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：,對(duì)樣品具有一定的溶解能力，樣品組分不會(huì)沉淀在柱中流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng) 流動(dòng)相的黏度要盡量小流動(dòng)相的物化性質(zhì)要

5、與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣,流動(dòng)相流速的選擇：,內(nèi)徑 4.0mm，0.8ml/min內(nèi)徑 4.6mm， 1ml/min內(nèi)徑 10.0mm，5ml/min (半制備),二、 流動(dòng)相的準(zhǔn)備,流動(dòng)相選擇,使用高純度試劑（色譜級(jí)溶劑、高純水、鹽）反相柱，如C18柱（易吸附 極性小的物質(zhì)）流動(dòng)相：高極性?低極性 如：A= H2O, B=CH3OH or CH3CN

6、梯度應(yīng)用： 90% A 10%B ? 100% B,反相柱--注意： 除非有說(shuō)明，反相柱不能使用100% 水，否則會(huì)損壞固定相 !!若A相含鹽（NaCl, NaClO4）或?yàn)榫彌_液(磷酸、醋酸)（>10mM），B為有機(jī)相，則應(yīng)開(kāi)通C或D通道，為純水以緩沖A B通道的直接接觸,二、 流動(dòng)相的準(zhǔn)備,流動(dòng)相選擇,分離的樣品在A、B中均可溶 !!!例如：沉淀的發(fā)生 DNA + TFACu2+、Ni2+ + 磷

7、酸緩沖鹽跨膜肽段 + 水分離效果 （參照文獻(xiàn)，他人實(shí)驗(yàn)，自主摸索）,強(qiáng)陰離子SAX交換柱（易陰離子物質(zhì)）流動(dòng)相：低濃度鹽?高濃度鹽 （NaCl or 磷酸緩沖鹽）如：A= 50mM NaCl, buffer , B= 2 M NaCl梯度應(yīng)用： 100% A ? 100% B,強(qiáng)陰離子交換柱--注意：防止流動(dòng)相，通道，柱子生長(zhǎng)細(xì)菌，流動(dòng)相應(yīng)加 0.1-1 mM NaN3，操作時(shí)戴手套,二、 流動(dòng)相的準(zhǔn)備

8、,流動(dòng)相選擇,更換流動(dòng)相之前，必須事先閱讀色譜柱的說(shuō)明書(shū) !!（每根色譜柱均有獨(dú)立的說(shuō)明書(shū)和出廠報(bào)告：使用注意事項(xiàng)，恢復(fù)柱效，出廠壓力等）注意色譜柱對(duì)流動(dòng)相的要求 （pH值、有機(jī)溶劑）可用pH 值SAX柱 PN:880952-703： 2.0 ~ 7.0C18柱: Agilent Zorbax SB-C18, 880975-902: 1.0 ~ 8.0Eclipse XDB-C18: 2.0 ~ 9.0Kro

9、masil C18, PC-1025: 2.0~8.0,二、 流動(dòng)相的準(zhǔn)備,流動(dòng)相處理,0.22 ?m 濾膜過(guò)濾，除去懸浮顆粒所有含鹽、或含水溶劑，必須膜過(guò)濾 !!100% 色譜純有機(jī)試劑，最好過(guò)濾后使用 水膜(纖維素酯膜)：只含水和鹽，不含任何有機(jī)相 有機(jī)膜：有機(jī)相，有機(jī)相和水的混合相 有機(jī)相能溶解纖維素酯膜剛剛從純水儀接的水，可以不過(guò)濾直接使用過(guò)夜溶劑（保存

10、在4℃），重新過(guò)濾后可以使用適當(dāng)?shù)睦?：新近過(guò)濾的 100% 色譜純有機(jī)試劑流動(dòng)相現(xiàn)配現(xiàn)用，剩余的流動(dòng)相(水相)及時(shí)清理，試驗(yàn)間隔>2天，建議倒掉任何溶劑，如果有可見(jiàn)懸浮物、菌絲，不可使用 !!,二、 流動(dòng)相的準(zhǔn)備,流動(dòng)相處理,除氣，可提高分離效果（峰型）、延長(zhǎng)儀器壽命。除氣不好時(shí)，可能使再現(xiàn)性降低，甚至無(wú)法分離。在舊儀器上常見(jiàn)。脫氣機(jī)的處理速度非常有限，無(wú)法除去大量氣體（如氣泡）過(guò)濾后，使用前

11、，超聲儀超聲10-15 min,磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液易受到細(xì)菌和霉菌的影響，不得放置過(guò)夜，應(yīng)臨用現(xiàn)制。 注意：用緩沖液后不能直接換用有機(jī)溶劑(實(shí)驗(yàn)過(guò)程),三、開(kāi)機(jī)前的準(zhǔn)備,流動(dòng)相檢查,泵的入口：有機(jī)溶劑在上(B,C 通道)，水相在下(A,D 通道)（避免鹽沉淀）溶劑體積檢查 – 與程序中體積一致。除去管路內(nèi)的氣泡。每次取出、放回 玻璃過(guò)濾頭均需要檢查!!清理廢液瓶,2. 計(jì)算機(jī) IP 地址的檢查,3. 關(guān)閉脫機(jī)程序,

12、四、開(kāi)機(jī),開(kāi)機(jī)注意事項(xiàng),先開(kāi)HPLC儀器開(kāi)關(guān)，脫氣機(jī)，泵和紫外檢測(cè)電源等各電源開(kāi)啟后(30s), 打開(kāi)在線軟件在線程序上，先開(kāi)啟泵，暫不開(kāi)紫外燈。走平衡時(shí)，打開(kāi)紫外燈設(shè)置梯度和波長(zhǎng)，或引用方法(注意檢測(cè)的紫外波長(zhǎng))設(shè)置文件保存路徑,具體的操作事項(xiàng)見(jiàn)HPLC開(kāi)機(jī)操作步驟,四、開(kāi)機(jī),排氣,-- 除去管路內(nèi)可能殘留的氣泡,旋開(kāi)Purge閥 ，流速?gòu)? ml/min升至到5 ml/min，壓力應(yīng)該< 10 bar如果

13、壓力明顯大于10 bar，可能是過(guò)濾白頭堵塞，需要更換、或清洗。過(guò)濾白頭通?？梢允褂?-6個(gè)月，如果過(guò)快，可能是流動(dòng)相不清潔。檢查過(guò)濾過(guò)程的錯(cuò)誤。逐個(gè)處理每個(gè)需要使用的流動(dòng)相 3 ~ 5 min，5 ml/min注意：管路中如果看到氣泡，不可使用泵排氣!!! 必須事先手工排出氣泡。,,,進(jìn)樣,平衡壓力,洗柱壓力,最大壓力,五、實(shí)驗(yàn)步驟,注意壓力的變化,五、實(shí)驗(yàn)步驟,樣品分析,平衡柱子 10-15min,反相:90% A水相

14、,10% B有機(jī)相陰離子交換:100% A 低鹽相,進(jìn)樣針進(jìn)樣,扳下定量環(huán)進(jìn)入設(shè)好的梯度程序(20-30 min)清洗柱子10 -15min(100% B),………………………,平衡柱子 10-15min………..,注意壓力的變化,五、實(shí)驗(yàn)步驟,數(shù)據(jù)分析,打開(kāi)脫機(jī)程序,找到相應(yīng)文件雙擊打開(kāi),查看保留時(shí)間,峰高,峰面積 等簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)處理----截屏導(dǎo)出數(shù)據(jù),文本形式,origin 作圖,六、實(shí)驗(yàn)結(jié)束,清洗色譜柱、定

15、量環(huán) 、進(jìn)樣針,C18 反相柱應(yīng)保存于純有機(jī)溶劑中，不含任何 酸、鹽！洗凈殘余的酸(TFA)、緩沖鹽 （用90% 純水、10%有機(jī)溶劑，5柱體積）除去水（用100% 有機(jī)溶劑，如甲醇 5柱體積）離子交換柱旋開(kāi)purge 閥,純水清洗通道(A,D) 5ml/min 清洗5min.純水洗去柱子的鹽溶液, 5柱體積的水5柱體積純有機(jī)相保存柱子,建議乙腈.,用數(shù)倍體積的甲醇沖洗定量環(huán)和進(jìn)樣針（或結(jié)合在下面步驟中）,進(jìn)樣

16、針保存好,如果當(dāng)天實(shí)驗(yàn)結(jié)束較晚、且次日早晨繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，清洗步驟可適當(dāng)從簡(jiǎn)。(必須確保酸、鹽不過(guò)夜),六、實(shí)驗(yàn)結(jié)束,更換流動(dòng)相,旋松Purge閥，流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)色譜柱將四個(gè)過(guò)濾頭均存放于有機(jī)溶劑瓶中，以防長(zhǎng)菌先用純水將含緩沖鹽的管路洗凈再用甲醇/乙腈將水排出, 充滿柱子,如果當(dāng)天實(shí)驗(yàn)結(jié)束較晚、且次日早晨繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，在確保安全的條件下（無(wú)腐蝕、不會(huì)長(zhǎng)菌） ，此步驟可不做。,關(guān)閉程序和儀器電源,先把流速調(diào)為0, 壓力將為0或1bar,再關(guān)閉

17、軟件程序(泵和紫外).依次關(guān)閉脫氣機(jī),泵和紫外檢測(cè)器的電源,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),一 色譜柱二 進(jìn)樣閥三 通道和脫氣機(jī)四 泵五 紫外檢測(cè)設(shè)備六 其它,,,Eclipse XDB-C18, 5u, 4.6*150mmZorbax SB-C18 5u, 4.6*250mmZorbax SAX 5u, 4.6*250mmZorbax SAX 5u, 4.6*250mm,一

18、 色譜柱,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,實(shí)驗(yàn)室色譜柱統(tǒng)計(jì)：,Agilent 公司,PN:993967-902SN:USKH031706LN:B07016,,PN:880975-902SN:USCL024985LN:B07051,,PN:880952-703SN:USA0006475LN:ZBX0759005,,PN:880952-703SN:USKH031706LN:B07016,,,Phenomenex公司,Kroma

19、sil 5u C18 10*250mm (半制備) 貨號(hào)：PC-1025 柱號(hào)：809110Kromasil 5u C18 4.6*250mm 貨號(hào)：PC-1025 柱號(hào)：06L25536 柱號(hào)： 90318,,1、色譜柱的使用說(shuō)明 √儲(chǔ)存液, PH值適用范圍2、色譜柱的保存 3、色譜柱的再生

20、 √色譜柱是消耗品，隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加,柱效下降4、色譜柱在使用過(guò)程中易出現(xiàn)的問(wèn)題和解決辦法 ,柱壓升高等,一 色譜柱,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,使用說(shuō)明書(shū)和出廠報(bào)告:,一 色譜柱,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,故障癥狀,A. 色譜柱柱壓,B. 色譜峰峰形,,C. 保留時(shí)間,,峰形問(wèn)題多 是復(fù)合型問(wèn)題,保留，色譜柱和分析結(jié)束時(shí)間都發(fā)生改變,解決辦法詳見(jiàn):色譜柱維護(hù),（1）色譜柱頭的過(guò)濾篩板堵塞或污染； 解決方法

21、：如確定是色譜柱頭的過(guò)濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。 （2）色譜柱頭的填料被樣品污染； 解決方法：如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。 （Ⅲ）色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶

22、析出；解決方法：如確定定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。 （4）流動(dòng)相PH值過(guò)大或過(guò)小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。解決方法：如果因PH值使用不當(dāng)，很難恢復(fù) 。,一 色譜柱,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,柱壓升高部分常見(jiàn)原因及解決辦法：,柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng),,更換色譜柱時(shí)，配件的使用,預(yù)柱,,,,預(yù)柱套 預(yù)柱芯,,,預(yù)柱,,Agilent 都有預(yù)柱，柱套 不變，更換柱

23、芯，注意方向,預(yù)柱,,1. 為了防止虹吸應(yīng)注意使第五第六號(hào)放空管的出口與進(jìn)樣口保持在同一平面.2. 為了更好的重現(xiàn)性，進(jìn)樣體積最好是樣品環(huán)的5-6倍。3. 一定要使用合規(guī)格的進(jìn)樣器，規(guī)格為外徑0.028英寸，長(zhǎng)2英寸的平頭針。一定不能使用尖針！它會(huì)嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈。4.轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在進(jìn)樣閥的中間位置5.常用密封墊的材質(zhì)適用pH<10,樣品溶液pH小于10； 否則換特氟隆材質(zhì)的密封墊pH10-136..

24、進(jìn)完樣后一定要及時(shí)沖洗進(jìn)樣器，特別是用鹽或緩沖液作流動(dòng)相由于這些溶液會(huì)形成結(jié)晶從而磨損墊圈。沖洗方法：A. 將進(jìn)樣器轉(zhuǎn)至Inject位置，利用液相泵輸送高純水沖洗(這時(shí)是沖洗樣品環(huán)及溝槽）.B.用閥清洗接頭和注射器沖5. 經(jīng)常用濕潤(rùn)的軟布清潔進(jìn)樣器，特別是進(jìn)樣口周?chē)?二 進(jìn)樣閥,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,注意事項(xiàng):,二 進(jìn)樣閥,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,通常結(jié)合兩方面：1 從進(jìn)樣器觀察，進(jìn)樣后將針拔出，若從進(jìn)樣口或排空

25、管有液體冒出，顯示密封圈磨損。2 從結(jié)果看：通常有壓力不穩(wěn)定，峰面積或保留時(shí)間不穩(wěn)定和殘留嚴(yán)重。,如何判斷手動(dòng)進(jìn)樣器的密封圈漏？,a) 扳到load的位置，進(jìn)樣時(shí)選擇勻速慢推，進(jìn)樣量要大于定量環(huán)的兩倍以上。 如果要進(jìn)樣量小于定量環(huán)，最好，進(jìn)樣體積小于定量環(huán)的一半。b) 進(jìn)樣后，迅速的將扳手扳到inject位置，2-3min 后把進(jìn)樣針取出，不要把針長(zhǎng)時(shí)間留在進(jìn)樣器上，因?yàn)獒樤谏厦?，針筒很重，針尖?huì)受到比較大的力，針尖容易變形，時(shí)間

26、長(zhǎng)了，就會(huì)變形，也會(huì)影響進(jìn)樣的準(zhǔn)確性。c)進(jìn)樣針，每次用了都要及時(shí)用溶劑清洗。避免溶液殘留，堵塞塞針。最后要用甲醇清洗，以防生銹。d)手動(dòng)進(jìn)樣器在扳動(dòng)的時(shí)候，手旋轉(zhuǎn)的時(shí)候，要尋找轉(zhuǎn)動(dòng)的軸心和進(jìn)樣的圓形一直，否則費(fèi)力，而且容易把手動(dòng)進(jìn)樣扳壞。,如何準(zhǔn)確進(jìn)樣,三 通道和脫氣機(jī),Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,溶劑過(guò)濾器堵塞或長(zhǎng)菌1:1 HNO3 (35%) 浸泡1小時(shí)，超純水洗凈,建議不使用超聲波清洗機(jī)清洗,定期清洗溶劑過(guò)濾器及溶劑瓶，

27、每三個(gè)月至少清洗一次管路長(zhǎng)菌的現(xiàn)象－擰開(kāi)脫氣機(jī)出口或比例閥入口管線，并使液面高于出口30cm此時(shí)溶劑會(huì)因?yàn)橹亓α鞒?，脫氣機(jī)或溶　劑過(guò)濾頭堵塞時(shí)，溶劑會(huì)流出不暢或不流出。－查看過(guò)濾器是否變色．管道和瓶中是否有細(xì)微狀物－臨時(shí)取下過(guò)濾器，檢查柱前壓力是否正常原因：雖然將玻璃濾頭放置在甲醇中，管路中仍然是含水溶液處理：旋開(kāi)purge閥50℃水沖洗管道30min, 100% 異丙醇低速(0.5-0.8ml/min)沖洗管路數(shù)小時(shí),甲醇

28、或乙腈沖洗管路,,污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類(lèi)生長(zhǎng)將會(huì)縮短溶劑過(guò)濾器的使用壽命，并且影響泵的運(yùn)行。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此。下列建議將會(huì)延長(zhǎng)溶劑過(guò)濾器的使用壽命并維持泵的運(yùn)行。使用滅過(guò)菌的溶劑瓶來(lái)減緩藻類(lèi)生長(zhǎng)。使用新鮮配制的流動(dòng)相，特別是水溶劑或鹽緩沖液建議不超過(guò)兩天。如果應(yīng)用許可，在溶劑中加入0.0001－0.001 M的疊氮化鈉。避免溶劑瓶暴露在直射陽(yáng)光下。用氬氣置換流動(dòng)相上層的空氣,三 通道和

29、脫氣機(jī),Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,防止堵塞溶劑過(guò)濾器,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,三 通道和脫氣機(jī),2)將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面(或較高處)。,四 泵,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,如何更好地使用四元泵,,1),操作泵之前，用至少兩個(gè)體積（標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)30ml，對(duì)微脫氣機(jī)10ml）沖洗真空脫氣機(jī),特別是當(dāng)泵關(guān)閉了一段時(shí)間后（例如，過(guò)夜），以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時(shí)。,3),四 泵,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,五

30、 紫外設(shè)備,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,燈：紫外區(qū)域采用有通光狹縫的氘燈作光源， 低壓氘氣體的等離子體能發(fā)出190nm到大約800 nm的光?？梢?jiàn)光（VIS）和近紅外光采用低噪音鎢燈得到， 其發(fā)射出的光譜范圍為470---950 nm,五 紫外設(shè)備,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,注意事項(xiàng):,紫外燈不要頻繁開(kāi)啟,燈關(guān)閉,2h 之后才可以再開(kāi). 有些過(guò)程不需要開(kāi)紫外燈,如:更換色譜柱,脫氣,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相保存柱子的過(guò)程等.,紫外

31、燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時(shí)打開(kāi)檢測(cè)器，20分鐘后可以進(jìn)行檢測(cè)；在分析完閉后，先關(guān)紫外燈。（頻繁的開(kāi)關(guān)燈會(huì)縮短燈的使用壽命）樣品池要常清洗,日常操作條件,最好是恒溫、恒濕 溫度：15-30℃ 相對(duì)濕度<80% 房間應(yīng)有良好的通風(fēng) 空調(diào)或其他設(shè)備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器 避免光線直射 遠(yuǎn)離高電干擾、高振動(dòng)設(shè)備,六 其它,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,六 其它,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù),,及時(shí)清理臺(tái)面、定

32、期擦拭儀器,清理灰塵 剩余的含水流動(dòng)相及時(shí)處理,不要長(zhǎng)時(shí)間放置流動(dòng)相的廢液分類(lèi)處置,環(huán)境清潔,實(shí)驗(yàn)記錄,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中時(shí)刻注意壓力等試驗(yàn)參數(shù)的變化,并做好實(shí)驗(yàn)記錄熟悉/記錄每個(gè)色譜柱(1ml/min)在不同流動(dòng)相不同梯度下的壓力,防止出現(xiàn)異常而不知的情況.需要記錄的壓力包括:洗柱壓力,平衡壓力,試驗(yàn)梯度中的最大壓力.如果壓力明顯過(guò)高，檢查原因(任何堵塞）;壓力突然降低 – 檢查漏液。,,,,,實(shí)驗(yàn)室電子記錄,六 其它,Ⅲ HPLC

33、 的保養(yǎng)與維護(hù),,進(jìn)樣,平衡壓力,洗柱壓力,最大壓力,,,,,壓力異常,IV 錯(cuò)誤實(shí)例,,錯(cuò)誤實(shí)例,現(xiàn)象：5ml/L 時(shí)壓力>10bar,或換過(guò)濾白頭后很快又堵塞原因：過(guò)濾時(shí)濾膜使用錯(cuò)誤水溶液 – 水性濾膜 （?）有機(jī)溶劑 – 有機(jī)膜 （?）混合溶劑 – 有機(jī)膜 （?）水溶液 – 有機(jī)濾膜 （? ）混合溶劑 – 水性膜（ ? 膜被溶解）處理：更換過(guò)濾白頭，見(jiàn)更換視頻。 換掉的過(guò)濾白頭進(jìn)一步

34、清洗，超聲等。,過(guò)濾白頭堵塞,管路長(zhǎng)菌,現(xiàn)象：原因：處理：,Ⅲ HPLC 的保養(yǎng)與維護(hù)三 通道和脫氣機(jī),見(jiàn)ppt,,錯(cuò)誤實(shí)例,排氣不干凈,現(xiàn)象：排氣時(shí)出液管中總是有氣泡原因：更換溶劑瓶時(shí)大量空氣進(jìn)入、沒(méi)有手工排氣結(jié)果：可能需要連續(xù)排氣1 - 2小時(shí)如果空氣進(jìn)入柱子非?？赡軗p壞色譜柱處理：溶劑先超聲10-15min。若系統(tǒng)引入大量空氣需要異丙醇脫氣，不經(jīng)過(guò)柱子。,IV 錯(cuò)誤實(shí)例,,系統(tǒng)漏液,現(xiàn)象：儀器會(huì)自動(dòng)檢測(cè)到液體而

35、自動(dòng)停止試驗(yàn)原因：接口漏液，泵漏液，紫外等處漏液處理：停止試驗(yàn)，找出漏液端，進(jìn)一步分析原因，采取相應(yīng)措施，更換器件或維修,錯(cuò)誤實(shí)例,泵的柱塞桿密封圈磨損,現(xiàn)象：泵端漏液，下方有積液，泵自動(dòng)關(guān)閉原因：密封圈磨損后，導(dǎo)致有間隙存在。流動(dòng)有顆粒存在或析出鹽都會(huì)加速其磨損處理：更換密封墊。,IV 錯(cuò)誤實(shí)例,,錯(cuò)誤實(shí)例,色譜柱堵塞,現(xiàn)象：壓力偏高,比正常情況下高幾十bar處理：確定是色譜柱還是系統(tǒng)堵塞:斷開(kāi)系統(tǒng)與柱子的接口,1ml/m

36、in 流速, 壓力在10bar 左右,說(shuō)明不是系統(tǒng)引起;若壓力明顯很高,有可能是系統(tǒng)某部位堵塞.確定是色譜柱還是預(yù)柱堵塞,斷開(kāi)預(yù)柱與柱子的接口,1ml/min 流速, 壓力在30bar 左右,說(shuō)明不是預(yù)柱引起;若壓力明顯很高,很可能是預(yù)柱堵塞.確定是色譜柱堵塞,分析是什么原因引起.,IV 錯(cuò)誤實(shí)例,,錯(cuò)誤實(shí)例,錯(cuò)誤現(xiàn)象分析的一般流程,IV 錯(cuò)誤實(shí)例,,異?，F(xiàn)象,,分析原因,詢(xún)問(wèn)實(shí)驗(yàn)室人員咨詢(xún)Agilent客服網(wǎng)上查詢(xún),,,維修處

37、理,,運(yùn)行驗(yàn)證,,繼續(xù)試驗(yàn),停止,試驗(yàn),請(qǐng) 閱讀 使用手冊(cè) !!,如有不確定的問(wèn)題，請(qǐng)及時(shí)咨詢(xún):（公司、手冊(cè)、Agilent網(wǎng)站、他人、經(jīng)驗(yàn)交流網(wǎng)站 ）,如有不確定的問(wèn)題，請(qǐng)及時(shí)咨詢(xún):（公司、手冊(cè)、Agilent網(wǎng)站、他人、經(jīng)驗(yàn)交流網(wǎng)站 ）,常用網(wǎng)站,Agilent客服電話: 8008203278,Agilent Technologies: http://www.chem.agilent.com/en-US/Pages/Homepa