全自動血液分析儀

1、第三章 血細胞分析儀檢驗,,,簡介,手工計數(shù)法的局限性儀器優(yōu)勢：精度高、速度快、易操作、功能強血液分析儀發(fā)展血液分析儀功能：細胞計數(shù)、白細胞分類、擴展功能,★20世紀50年代，美國庫爾特（W.H.Coulter）發(fā)明電子血細胞計數(shù)儀并申請專利。,血液分析儀優(yōu)勢檢測項目多速度快精度高易操作,第一節(jié) 檢測原理,1.電學(xué)2.光學(xué),,電阻法,射頻電導(dǎo)法,,激光散射法：染色和非染色,分光光度法---檢測血紅蛋白,,一.

2、血細胞計數(shù)原理,電阻抗法,經(jīng)典的庫爾特原理,測量細胞數(shù)量和體積三分群血液分析儀主要原理,電阻抗法,血小板與紅細胞同一檢測通道特殊裝置輔助:掃流技術(shù)、鞘流技術(shù)、浮動界標(biāo)。,射頻電導(dǎo)法,電磁波通過細胞發(fā)生衰減，與細胞內(nèi)部化學(xué)成分、核質(zhì)比、顆粒等有關(guān)。特別有助于鑒別體積相同，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的細胞。,激光散射法,在不同角度測定散射光強度，與細胞表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部顆粒、細胞核有關(guān)。比電阻抗法分群準確，是五分類儀器主要檢測原理。,,光源：氣體激光、

3、固體激光、鎢光源鞘流：流體動力聚焦細胞懸液光檢測器,,,,,,,,,,,,1,4,3,激光散射法示意圖,1樣本流2鞘流液3激光源4透鏡5低角度散射光6高角度散射光,,,6,5,,,,2,,激光散射法,低角度散射光（前向散射光），反映細胞大小和數(shù)量。高角度散射光（側(cè)向散射光），反映細胞內(nèi)部顆粒、細胞核等。流式細胞術(shù)光散射：熒光染色，得到熒光強度信號，與細胞所含核酸有關(guān)。優(yōu)于阻抗法，是五分類儀器的主要原理之一。,12,,

4、,,半導(dǎo)體激光,染色后的白細胞,FCM原理,激光散射法運用,白細胞計數(shù)紅細胞計數(shù)： 低角度(2°～3°)：測量紅細胞體積。 高角度(5°～15°)：測定血紅蛋白濃度。血小板計數(shù)： 低角度(2°～3°)：測量細胞大小。 高角度(5°～15°)：測量細胞密度。可與小RBC、RBC碎片區(qū)分。 加入熒光染色，成熟RBC無D

5、NA/RNA，不被染色。未成熟血小板染色較成熟血小板強。,網(wǎng)織紅細胞檢測原理,對網(wǎng)織紅細胞內(nèi)RNA成分染色。染色劑有：非熒光染料（新亞甲藍）和熒光染料(噁嗪、聚次甲基）非熒光染料染色法：VCS技術(shù) RNA越多光散射越強，可檢測網(wǎng)織紅細胞成熟度 得到參數(shù)：Ret%、 Ret#、IRF\HLR\MCVr\RDWr,網(wǎng)織紅細胞參數(shù)檢測原理,熒光染料染色法 聚次甲基染RNA、噁嗪染DNA,RBC,LFR,PLT,MFR

6、,HFR,,得到參數(shù)：Ret%、 Ret#HFR\MFR\LFRIRF\ Ret-He,熒光強度,前向散射光,有核紅細胞參數(shù)檢測原理,VCS法 非白細胞區(qū)域：有核紅、血小板聚集、大血小板、瘧原蟲等。流式細胞激光散射法 聚次甲基熒光染色：NRBC裸核化，熒光強度比白細胞低。,前向散射光,側(cè)向熒光,,二. 白細胞分類原理,,白細胞三分群原理,★白細胞直方圖儀器將體積為35～450fL的血細胞，分為256個通道（c

7、hannel）。每個通道：1.64fl。根據(jù)細胞大小，分別置于不同的通道中，顯示血細胞體積分布直方圖(Histogram)。,★白細胞直方圖,,1.35-90fl小細胞群：淋巴2.90-160fl中間細胞群：單核、嗜酸、嗜堿、幼稚3.160-450fl大細胞群：中性粒細胞,直方圖出現(xiàn)異常，不同部位有不同含義,,,,體積 電導(dǎo) 光散射,白細胞五分類檢測原理,VCS原理,VCS,,,旋轉(zhuǎn)光散射,體積,

8、激光散射法（鎢光源）、過氧化物酶染色,過氧化物酶活性強度：嗜酸>中性粒細胞>單核。淋巴和嗜堿細胞無過氧化酶活性,★流式細胞光散射、電阻抗、射頻、特殊細胞染色,1.4DIFF通道 阻抗+射頻：分粒細胞、淋巴、單核三群 流式光散射：溶解紅細胞、血小板，白細胞熒光染色，熒光強度與細胞所含核酸有關(guān)。先分四群：中性粒細胞和嗜堿細胞，淋巴，單核，嗜酸和未成熟粒細胞。2.嗜酸細胞通道3.WBC/BASO通道 堿性

9、溶血劑破壞其他白細胞。4.IMI通道 加入硫化氨基酸，與幼稚細胞結(jié)合，且不被溶血劑溶解。,,,WBC/BASO通道,完成五分類,多角度偏振光散射法（MAPSS),紅細胞內(nèi)血紅蛋白逸出，鞘液進入，折光系數(shù)與鞘流相當(dāng)，不干擾白細胞檢測。4個角度：0°前向散射光：細胞大小、數(shù)量10°側(cè)向散射光：細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和核染色質(zhì)的復(fù)雜性。90°偏振光：細胞內(nèi)顆粒及核分葉情況90°D垂直角度去偏振

10、散射光：鑒別嗜酸細胞,MAPSS,雙流體（雙鞘流）動力連續(xù)系統(tǒng),雙鞘流：有2個鞘流裝置，經(jīng)第一束鞘流后用阻抗法測細胞體積，經(jīng)第二束鞘流后測定光吸收測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。1.白細胞計數(shù)通道：電阻抗2.白細胞分類通道：雙鞘流+細胞化學(xué)染色 染液中含溶血素及氯唑黑E，對單核細胞初級顆粒、嗜酸顆粒、中性顆粒及細胞膜（細胞膜、核膜、顆粒膜）染色。3.嗜堿性粒細胞通道,分光光度法,測定血紅蛋白:溶血劑使紅細胞溶血，釋放出血紅蛋白，血紅

11、蛋白與溶血劑中某些成分結(jié)合，形成穩(wěn)定化合物，在特定的光波（530-550nm）下比色，吸光度變化與血紅蛋白濃度成正比(Lambert-Beer比色定律)。溶血劑 1.含氰化物：形成氰化血紅蛋白，540nm(改良HiCN 法）。氰化 物有毒。 2.不含氰化物:如SLS（月桂酰硫酸鈉）法，需用HiCN校準。,方法學(xué)評價,三分類已較少用五分類，準確度及精密度更高。仍無法取代人工鏡檢。,,第二節(jié) 臨床應(yīng)用,紅細胞參數(shù),

12、紅細胞體積分布寬度（RDW）反映紅細胞大小不一致的程度，與MCV結(jié)合，用于貧血的分類。RDW-SD和RDW-CV。1.鑒別均為小細胞低色素的貧血2.早期診斷缺鐵性貧血2.MCV和RDW均增高：巨幼細胞性貧血3. MCV和RDW均正常：再障、慢性失血性貧血,紅細胞參數(shù),血紅蛋白分布寬度（HDW）反映紅細胞內(nèi)HB含量異質(zhì)性。HDW和RDW明顯增高，見于遺傳性球形紅細胞增多癥（小細胞不均一性高色素）。HDW增高，RDW正常

13、見于輕型β-珠蛋白生成障礙性貧血。球形細胞平均體積（MSCV)遺傳性球形紅細胞增多癥MSCV<MCV,血小板系列參數(shù),血小板平均體積（MPV)、未成熟血小板比率（IPF) 、血小板分布寬度（PDW)MPV正常人MPV與PLT呈非線性負相關(guān)。1.鑒別血小板減低的原因： MPV增高，骨髓增生功能良好，血小板減低是由于血小板破壞過多； MPV減低，再障或急性白血病。2.評估骨髓造血功能恢復(fù)情況：造血功能恢復(fù)時，MPV增

14、高早于PLT增高。3.原發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）PLT、MPV、PDW？★ IPF網(wǎng)織血小板是胞質(zhì)中殘留RNA的血小板。鑒別血小板減低的原因：骨髓造血功能良好時， IPF增高。,網(wǎng)織紅細胞參數(shù),未成熟網(wǎng)織紅細胞比率（IRF）、網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)（RMI)、Ret-He用于評估骨髓造血功能，貧血的鑒別診斷。1. IRF、 RMI ：腫瘤化療、干細胞移植骨髓造血功能受抑和恢復(fù)最早的指標(biāo)（早于WBC、PLT、Ret）

15、 IRF =(MFR+HFR）/(LFR+MFR+HFR)*100 RMI=(MFR+HFR）/LFR*1002. Ret-He網(wǎng)織紅細胞血紅蛋白含量：反映網(wǎng)織紅細胞質(zhì)量，對缺鐵貧的治療有意義。,白細胞系列參數(shù),中間細胞群MID、未成熟粒細胞IG、造血祖細胞HPCMID：單核細胞、嗜酸、嗜堿、幼稚細胞、異淋、漿細胞IG：早幼粒細胞至桿狀核粒細胞各階段，不包括原始粒細胞。HPC：干細胞移植時，檢測供體HPC變化，便于

16、選擇采集時機。,,第三節(jié) 血細胞分析儀 檢驗圖形與臨床應(yīng)用,第二節(jié) 檢測參數(shù)和結(jié)果顯示,儀器應(yīng)滿足的兩個要求：1.篩檢和直接報告正常結(jié)果2.報警提示異常結(jié)果：結(jié)果超出范圍、細胞異常、標(biāo)本干擾等結(jié)果顯示：數(shù)據(jù)、圖形（直方圖、散點圖）、報警（圖形、符號、文字） 直方圖：曲線圖形，XY軸？ 散點圖：點組成的圖形，XY軸？,數(shù)據(jù),參考值,符號,,,,,直方圖,★白細胞直方圖儀器將體積為35

17、～450fL的血細胞，分為256個通道（channel）。每個通道：1.64fl。根據(jù)細胞大小，分別置于不同的通道中，顯示血細胞體積分布直方圖(Histogram)。,★白細胞直方圖,,1.35-95fl小細胞群：淋巴2.95-160fl中間細胞群：單核、嗜酸、嗜堿、幼稚3.160-450fl大細胞群：中性粒細胞,直方圖出現(xiàn)異常，不同部位有不同含義,正常白細胞直方圖,異常白細胞直方圖,,,分析白細胞直方圖應(yīng)注意：溶血劑處理

18、后白細胞直方圖變化必須使用配套試劑不同儀器的直方圖不同,★紅細胞直方圖,1.近似正態(tài)分布，單峰， 36-360fl監(jiān)測，主要分布于50-200fl2.橫坐標(biāo)：細胞體積；縱坐標(biāo)：細胞的出現(xiàn)頻率3.異常圖形：左移右移、峰高低、峰寬窄、雙峰等,紅細胞異常直方圖,★血小板直方圖,1.左偏態(tài)分布，單峰，主要在2-15fl，2-30fl檢測2.異常圖形：大血小板、血小板聚集、小RBC、RBC碎片,散點圖-白細胞,每一條軸分別表示一種檢測原

19、理或檢測角度的細胞信息，任何一個點反映的是綜合信息。散點上下、左右、前后的變化與細胞大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、顆粒、胞核胞質(zhì)等有關(guān)。,散點圖-紅細胞,紅細胞體積/紅細胞血紅蛋白濃度（V/HC）散點圖：分九個區(qū)，有助于貧血的分類和診斷。,,第四節(jié) 血細胞分析儀 性能評價與全面質(zhì)量控制,性能評價,安裝新機或大維修后需進行儀器性能評價，包括：精密度 批內(nèi)精密度：同一批樣本重復(fù)測定結(jié)果的評價。 批間精密度：對兩批或

20、以上樣本重復(fù)測定結(jié)果的評價。 總精密度：同一標(biāo)本多次測量的結(jié)果接近程度，包含隨 機誤差和攜帶污染率雙重變異因素。準確性：測定結(jié)果與真值一致性的程度（表3-14）,準確度和精密度,★性能評價,線性范圍（稀釋效應(yīng)）：指測定值與稀釋倍數(shù)是否呈比例關(guān)系。線性關(guān)系范圍越寬越理想。P ＜ 0.01, 非線性相關(guān)；P ＞ 0.05，未偏離線性。,MCH,MCHC,MCV,RBC,★性能評價,攜帶

21、污染率 連續(xù)測定1份高值樣本3次（i1、i2、i3）再測定1份低值樣本3次（j1、j2、j3） 攜帶污染率（%）＝（j1-j3）/（i3-J3） 可比性（儀器與常規(guī)檢測程序）： 指血液分析儀測定結(jié)果，與常規(guī)方法所測結(jié)果相比較。顯微鏡法是血細胞檢驗基礎(chǔ)。對異常標(biāo)本和干擾物的靈敏度標(biāo)本老化：觀察標(biāo)本隨時間變化對結(jié)果的影響白細胞分類計數(shù)評價（表3-15）,全面質(zhì)量控制,質(zhì)量保證、儀器校準和性能評價均有國際公認的

22、一系列標(biāo)準文件。 質(zhì)量保證 分析前：環(huán)境、儀器、試劑、校準品、質(zhì)控品、參考 區(qū)間的設(shè)置、合格的檢測人員及標(biāo)本 分析中：室內(nèi)質(zhì)控、操作規(guī)范、報警處理、干擾因素分析、復(fù)檢規(guī)則 分析后：樣本保存、結(jié)果分析、征求臨床意見、室間質(zhì)評,,,,室內(nèi)質(zhì)量控制,,質(zhì)控品要求：穩(wěn)定血制品或新鮮全血,,1,,,至少兩個水平，頻率依工作量和儀器性能而定,2,,,更換新批號應(yīng)新舊批號同時檢測,3,,

23、,結(jié)果解釋：±2S（95%可信限）,4,報警,報警來源：標(biāo)本異常，超出項目參考范圍，符合復(fù)檢標(biāo)準報警形式：圖形、符號、文字報警信息：（表3-18---3-21)報警處理,干擾因素分析,RBC:WBC增加、RBC凝集、大PLT、PLT聚集HB：脂血、高膽紅素、WBC高、PLT高WBC：有核紅、未溶解RBC、WBC聚集PLT：小RBC、RBC碎片、PLT聚集、大PLT、WBC碎片,復(fù)檢規(guī)則,國際血液分析儀顯微鏡復(fù)檢規(guī)則

24、41條 鏡檢三方面內(nèi)容：1.取細胞分布良好的區(qū)域，估算WBC、PLT(正?？梢?-15個血小板/油鏡視野 )2.白細胞分類3.血細胞形態(tài)觀察（WBC、RBC、PLT）,福建省立醫(yī)院檢驗科復(fù)檢規(guī)則,鏡檢規(guī)則的驗證,1.檢測方法：每份標(biāo)本儀器測定后由2名有工作經(jīng)驗的檢驗人員按照標(biāo)準操作程序進行鏡檢。內(nèi)容包括：①WBC分類計數(shù)②WBC和PLT數(shù)量評估；③RBC和PLT的形態(tài)，有無PLT聚集；④其他異常：NRBC，RBC冷凝

25、集及寄生蟲等。2.涂片鏡檢陽性判斷標(biāo)準：① 紅系：發(fā)現(xiàn)瘧原蟲；NRBC≥1個；或其他形態(tài)異常>2+② 血小板聚集;血小板形態(tài)異常>2+③ Dohle小體的粒細胞>2+，中毒顆粒中性粒細胞>2+，空泡變性粒細胞>2+④ 原始和幼稚細胞≥1個，早幼粒細胞和中幼粒細胞≥1個 ，晚幼粒細胞>2個 ⑤ 非典型淋巴細胞>5個 ⑥ 漿細胞≥1個3. 統(tǒng)計要求假陰性率<5%（具有診斷意義