生化工程產(chǎn)品分離技術(shù)第一講緒論

1、生化分離技術(shù),第一講 緒 論,緒 論,第一節(jié) 概述第二節(jié) 生化產(chǎn)品分離技術(shù)的一般過(guò)程第三節(jié) 生化產(chǎn)品分離技術(shù)的發(fā)展,第一節(jié) 概述,一、生化分離技術(shù)的概念二、生化產(chǎn)品的特點(diǎn)三、生化分離技術(shù)的特點(diǎn)四、生化分離技術(shù)的重要性,,一、生化分離技術(shù)的概念,生化分離技術(shù)是指從發(fā)酵液或酶反應(yīng)液中，分離純化生物產(chǎn)品的過(guò)程。它是生物技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力不可缺少的重要環(huán)節(jié)，又稱為生物技術(shù)下游加工技術(shù)。,,二、生化產(chǎn)品的特點(diǎn),1)、應(yīng)用面廣。 醫(yī)藥

2、衛(wèi)生、環(huán)保、動(dòng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、食品和試劑等2)、生化產(chǎn)品種類繁多，包括了大、中、小分子量的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)復(fù)雜又各異的生物活性物質(zhì)，生物活性各異。3)、目的產(chǎn)物在初始物料中的含量低。 青霉素（4.2%）、慶大霉素 （0.2%）、干擾素（<50ug/ml）。4)、產(chǎn)品價(jià)格與產(chǎn)物濃度呈反比:,5)、初始物料成分復(fù)雜。除少量產(chǎn)物外，還有大量的細(xì)胞及碎片、其他代謝物（幾百上千種）、培養(yǎng)基成分、無(wú)機(jī)鹽等。6)、生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定

3、性低。易變質(zhì)、易失活、易變性，對(duì)溫度、pH值、重金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等非常敏感。7)、產(chǎn)品的質(zhì)量要求高，尤其是藥品等。成品青霉素對(duì)其強(qiáng)致敏原 –青霉噻唑蛋白必須控制RIA值（放射免疫測(cè)定）小于100（1.5×10-6），蛋白類藥物（雜質(zhì) < 2%）、重組胰島素（Humulin）中雜蛋白小于0.01%。,三、生化分離技術(shù)的特點(diǎn),1. 純化步驟多，操作繁瑣，產(chǎn)品收率低、生產(chǎn)成本高。2. 分離純化的產(chǎn)品通

4、常穩(wěn)定性差，容易失去生物活性，或被分解、降解。3. 從發(fā)酵液中分離產(chǎn)品時(shí)，不宜存放太久，應(yīng)盡快提取。,,條件溫和，特別對(duì)具有生物活性的物質(zhì)，在后處理過(guò)程中必須保持其生物活性；分離純化技術(shù)的選擇性好、專一性強(qiáng)，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，以達(dá)到較高的分離純化倍數(shù)；目的產(chǎn)物的量和活性具有較高的收率；,四、生化分離技術(shù)的重要性,1)、生化產(chǎn)品的必經(jīng)的過(guò)程。2)、回收率不高?？股?80%左右)，蛋白質(zhì)(60-90%

5、)。3)、分離純化昂貴。下游研究費(fèi)用占整個(gè)費(fèi)用的50%以上；產(chǎn)品的成本構(gòu)成中分離純化的成本站全部成本的40-80%; 精細(xì)和藥用產(chǎn)品的成本比率更高; 大多數(shù)酶70%。,,4)、基因工程的費(fèi)用，下游占50-80%。基因工程表達(dá)產(chǎn)品成本85-90%；勞動(dòng)力和物力成本占整個(gè)勞動(dòng)力的70-90%。5)、中藥現(xiàn)代化的重要技術(shù)平臺(tái)。農(nóng)學(xué)、分離科學(xué)、生化分析、藥學(xué)等6)、提供產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵技術(shù)之一，降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。7)、環(huán)境污染

6、的治理 。,五、發(fā)酵醪(發(fā)酵液)的一般特征,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵醪特性不同，其預(yù)處理方法和提取、精制方法的選擇也有差異。應(yīng)針對(duì)發(fā)酵醪的特性來(lái)合理選擇處理方法，大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在發(fā)酵醪中，也有少數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在菌體中，或發(fā)酵醪和菌體都 含有，例如四環(huán)類抗生素。各種發(fā)酵產(chǎn)物無(wú)論在發(fā)酵醪或是在菌中體現(xiàn)往往濃度較低，并與種種的溶解和懸浮的雜質(zhì)混在一起，要分離提純發(fā)酵產(chǎn)物，首先要針對(duì)發(fā)酵醪的特性進(jìn)行預(yù)處理。,發(fā)酵醪的

7、特性一般可歸納為：1、發(fā)酵醪大部分是水，一般含量達(dá)90%-99%.2、發(fā)酵醪中發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，盡管由于菌種、原料、工藝條件不同，發(fā)酵產(chǎn)物于發(fā)酵醪中濃度的高低也有差異，但總的來(lái)說(shuō)發(fā)酵醪中發(fā)酵產(chǎn)物濃度都是比較低的，除了酒精、檸檬酸、葡萄糖酸等發(fā)酵產(chǎn)物濃度在10%以上外，其余的都在10%以下，而抗生素的濃度更低，一般在1%以下。,3、發(fā)酵醪中的懸浮固體物主要含有菌體和蛋白質(zhì)膠狀物。由于發(fā)酵醪中存在一定數(shù)量的菌體和蛋白質(zhì)膠體物質(zhì)，不僅

8、使發(fā)酵醪粘度增加，不利于過(guò)濾，而且增加提取和精制后工序的操作困難，在濃縮過(guò)程中變得更粘稠，同時(shí)容易產(chǎn)生泡沫。采用溶媒萃取法提煉時(shí)，蛋白質(zhì)的存在奪產(chǎn)生乳化，使溶媒相和水相分層困難；采用離子交換法提煉時(shí)，蛋白質(zhì)的存在也會(huì)增加樹(shù)脂的吸附量，加重樹(shù)脂的負(fù)擔(dān),4、發(fā)酵醪的殘留成分中還含有無(wú)機(jī)鹽類，非蛋白質(zhì)大分子其降解產(chǎn)物培養(yǎng)基對(duì)提取和精制均有一定的影響。5、發(fā)酵醪中除了發(fā)酵產(chǎn)物外，常有其他少量的代謝產(chǎn)物。發(fā)酵過(guò)程中除了主代謝產(chǎn)物外，尚伴有一些其

9、他的副代謝產(chǎn)物。這些少量的副產(chǎn)物，有時(shí)其結(jié)構(gòu)特性與發(fā)酵主產(chǎn)物極為近似，這就會(huì)給分離提純操作帶來(lái)困難。6、發(fā)酵醪中還含有色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)。盡管它們的確切組成還不十分明了，但它們對(duì)提煉影響相當(dāng)大。為了保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)通過(guò)預(yù)處理將色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)先除去。,發(fā)酵成熟醪中常含有各種樣的雜質(zhì)，而所需要的發(fā)酵產(chǎn)物則含量很少。因此，要獲得純凈的發(fā)酵產(chǎn)物，它的提取與精制過(guò)程便成為一個(gè)復(fù)雜而必不可少的工藝過(guò)

10、程。提取和精制的目的在于從發(fā)酵液中制取高純度的、符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的發(fā)酵成品。 盡管由于菌種、發(fā)酵醪的特征及發(fā)酵工藝的不同，發(fā)酵產(chǎn)物可以多種多樣，但從工業(yè)發(fā)酵范疇來(lái)看，從發(fā)酵醪中獲得產(chǎn)物大致可分為三類：,六、發(fā)酵產(chǎn)物的分類,菌體 主要以菌體細(xì)胞作為發(fā)酵產(chǎn)品，如單細(xì)胞蛋白、面包酵母、飼料酶母等。此外就是從菌體細(xì)胞中提取有用的發(fā)酵產(chǎn)物，如由酵母細(xì)胞提取輔酶A、核糖核酸等產(chǎn)品。有的抗生素主要存在于菌絲體中，如灰黃霉素

11、產(chǎn)生菌在發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的灰黃霉素主要在菌絲中，因此，也要從菌絲體中進(jìn)行提取。酶 發(fā)酵產(chǎn)物為酶制劑，包括胞外酶和胞內(nèi)酶。如α-淀粉酶、β-淀粉酶、異淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶、右旋糖酐酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、轉(zhuǎn)化酶、蜜二糖酶、柚苷酶、花青素酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、天冬氨酸酶、青霉素酰胺酶、磷酸二酰酶、天冬酰胺酶等，均在工業(yè)上和醫(yī)藥上發(fā)揮作用。,,,代謝產(chǎn)物 中間代謝產(chǎn)物包括醋酸、乳

12、酸、檸檬酸、葡萄糖酸、衣康酸及延胡索酸等。氨基酸發(fā)酵產(chǎn)物包括谷氨酸、賴氨酸、色氨酸等。由于對(duì)菌種的變異和氨基酸代謝機(jī)理的研究日益深入，所以其他氨基酸，除蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸外，18種氨基酸均可用直接發(fā)酵法制造。,有機(jī)溶劑發(fā)酵產(chǎn)物包括酒精、丙酮、丁醇等。 核苷酸類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)物包括肌苷、肌苷酸以及鳥(niǎo)苷酸等。5`-肌苷酸和5`-鳥(niǎo)苷酸均為呈味核苷酸，核酸的微生物包括輔酶A、ATP、輔酶I等均為重要的醫(yī)藥品。

13、 抗生素發(fā)酵產(chǎn)物包括青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、慶大霉素、新霉素、紅霉素及利福霉素等。 多糖發(fā)酵產(chǎn)物包括右旋糖酐及多糖B-1459等。多糖是醫(yī)藥和工業(yè)上重要粘性物質(zhì)來(lái)源之一，右旋糖酐經(jīng)過(guò)部分水解后供代血漿用。多糖B-1459是水溶性、高分子量的胞外異多糖。 維生素發(fā)酵產(chǎn)物有核黃素、維生素C和維生素B12. 甾體氧化的產(chǎn)物為甾體激素，是重要的品。如醋酸可的松、氫化可的松、醋酸潑

14、尼松、氫化潑尼松等促皮質(zhì)激素及腎上腺皮質(zhì)激素制劑、黃體酮、甲孕酮（安宮黃體酮）等性激素、炔諾酮等避孕藥。,問(wèn)題,1、發(fā)酵醪有哪些特性？,2、發(fā)酵醪中獲得產(chǎn)物大致可分為 、 、 三類？,3、發(fā)酵液中的細(xì)胞代謝產(chǎn)物有哪些？分別舉出2個(gè)具體代表產(chǎn)物。,,第二節(jié) 生化產(chǎn)品分離技術(shù)的一般過(guò)程,一、工藝流程二、加工過(guò)程概述三、典型生化產(chǎn)品的分離實(shí)例,,生化生產(chǎn)過(guò)程的最后一個(gè)環(huán)節(jié)是

15、把目標(biāo)產(chǎn)物從培養(yǎng)液或反應(yīng)液中分離提取出來(lái)。多數(shù)生化產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中需經(jīng)微生物發(fā)酵、酶反應(yīng)過(guò)程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)，并通過(guò)包括產(chǎn)物回收、粗分離、純化及精制等處理后，才能符合一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在生物產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中一般將微生物發(fā)酵、酶反應(yīng)過(guò)程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)稱為“上游過(guò)程”，而與之相應(yīng)的產(chǎn)物回收、粗分離、純化及加工等后續(xù)過(guò)程就稱之為“下游過(guò)程”，或稱之為生化分離和純化過(guò)程。眾所周知，要使生物技術(shù)走向產(chǎn)業(yè)化，必須要上下游過(guò)程兼容、協(xié)調(diào)、以使全

16、過(guò)程能優(yōu)化進(jìn)行。,潔凈氣,產(chǎn)品,化工生產(chǎn)中的分離環(huán)節(jié),一、工藝流程,一般分為四個(gè)階段：（1）發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離（2）初步分離（3）產(chǎn)品提純（4）成品加工,不同的生化產(chǎn)品，由于自身的特性及其對(duì)純度要求的不同，所采用的分離純化路線常常也是不同的。例如從發(fā)酵液中提取和精制菌體和胞內(nèi)酶，就與分離與純化細(xì)胞的代謝產(chǎn)物有明顯的不同；同樣即使產(chǎn)物都屬于代謝產(chǎn)物，由于產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，其提取和精制的方法也就不同。但一般來(lái)說(shuō)，分離純化路線

17、都包括了兩個(gè)基本階段：產(chǎn)物的初級(jí)分離階段；產(chǎn)物的純化精制階段。,初級(jí)分離階段在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束之后，其任務(wù)是分離培養(yǎng)液、破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物（如果產(chǎn)物在胞內(nèi)）、溶解包涵體、復(fù)原蛋白質(zhì)、濃縮產(chǎn)物和去除大部分雜質(zhì)等。 純化精制階段是在初級(jí)分離的基礎(chǔ)上，用各種高選擇的手段和方法，將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能地分開(kāi)，使產(chǎn)物的純度達(dá)到相關(guān)的要求，成為級(jí)別的產(chǎn)品。 生物產(chǎn)品的后處理過(guò)程一般包括：發(fā)酵液的預(yù)處理；提?。痪迫齻€(gè)步驟

18、 。,生化分離工作的一般過(guò)程,動(dòng)、植物組織、體液等 胞外產(chǎn)物 提取發(fā)酵液 → 預(yù)處理 → c分離 → c破碎 → 碎片分離 → 初步純化 → 精制 → 制成品培養(yǎng)液 加 熱 沉 淀 勻 化 離 心

19、 沉 淀 分子篩 無(wú)菌過(guò)濾酶反應(yīng) 調(diào) pH 離 心 超 聲 萃 取 吸 附 離 子 超 濾 絮 凝 過(guò) 濾 胞 溶 過(guò) 濾 萃 取 親 和 凍 干

20、 錯(cuò)流過(guò)濾 研 磨 錯(cuò)流過(guò)濾 超 濾 吸 附 噴 干 憎 水 結(jié) 晶

21、 電 泳,,,,,,,圖 生物產(chǎn)品分離純化的一般步驟,發(fā)酵液或培養(yǎng)液,細(xì)胞產(chǎn)物,胞外產(chǎn)物,胞內(nèi)產(chǎn)物,離心或過(guò)濾細(xì)胞（洗滌）,離心或過(guò)濾（洗滌),離心或過(guò)濾（洗滌）,細(xì)胞破碎（化學(xué)法機(jī)械法等）,整體細(xì)胞萃取,

22、離心、過(guò)濾,干燥,分離劑回收、再生,提取、分離沉淀、吸附、萃取、過(guò)濾等,分離劑回收、再生,純化、精制層析、結(jié)晶、電泳等,干燥,廢物,產(chǎn)物,產(chǎn)物,濾液,循環(huán),副產(chǎn)物,廢物,濾渣,副產(chǎn)物,循環(huán),廢物,細(xì)胞,濾渣,副產(chǎn)物,廢物,細(xì)胞,含產(chǎn)物的清液,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,預(yù)處理階段,圖13-4生物分離工藝的基本流程,初始物料,細(xì)胞,固-液分離,溶液,細(xì)胞破碎,固-液分離,包涵體,固體,溶液,提取,變

23、性,復(fù)性,濃縮,粗分離,純化,精制,產(chǎn)品,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一、生物分離的基本過(guò)程,,,,,,二、加工過(guò)程概述,1.預(yù)處理和固液分離 預(yù)處理：改變反應(yīng)液的性質(zhì)（發(fā)酵液），有利于固液分離。 通常通過(guò)酸化和加熱降低發(fā)酵液的黏度；加入絮凝劑，使細(xì)胞或大分子聚結(jié)成較大顆粒。,固液分離：常用過(guò)濾、離心等方法 板框壓濾機(jī)、鼓式真空過(guò)濾機(jī)，應(yīng)用最廣泛的是碟式離心機(jī),板框壓濾機(jī),,通常發(fā)酵完成

24、后，發(fā)酵罐內(nèi)充滿了殘余的培養(yǎng)基、水、微生物和酶所形成的大量發(fā)酵液?？捎谜婵辙D(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)將酶與發(fā)酵液的其他成分分離開(kāi)來(lái)。,鼓式真空過(guò)濾機(jī),過(guò)濾機(jī)外涂有厚厚的一層硅藻土，水和酶可以滲透過(guò)去，而培養(yǎng)基和微生物卻被黏著在硅藻土表面上。,鼓式真空過(guò)濾機(jī),鼓式真空過(guò)濾機(jī),轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)旋轉(zhuǎn)的過(guò)程中，發(fā)酵液噴散開(kāi)來(lái)。水和酶被吸進(jìn)過(guò)濾機(jī)的中央，培養(yǎng)基和微生物則留在硅藻土表面，稍后用巨型刀片將硅藻土及附著其上的培養(yǎng)基及微生物一同去除。,離心澄清機(jī)的轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有數(shù)十

25、個(gè)至上百個(gè)形狀和尺寸相同、錐角為6O0～1200的錐形碟片，碟片之間的間隙用碟片背面的狹條來(lái)控制，一般碟片間的間隙約0.5～2.5mm。當(dāng)具有一定壓力和流速的懸浮液進(jìn)入離心澄清機(jī)后，就會(huì)從碟片組外緣進(jìn)入各相鄰碟片間的薄層隙道，由于離心澄清機(jī)高速旋轉(zhuǎn)，這時(shí)懸浮液也被帶著高速旋轉(zhuǎn)，具有了離心力。此時(shí)固體和液體因密度不同而獲得的離心沉降速度的不同，在碟片間的隙道間出現(xiàn)了不同的情況。,碟式離心機(jī),固體顆粒獲得的離心沉降速度大于后續(xù)液體的流速，則

26、有向外運(yùn)動(dòng)的趨勢(shì)，就沿碟片下表面離開(kāi)軸線向外運(yùn)動(dòng)，并連續(xù)向鼓壁沉降；澄清液獲得的離心沉降速度小于后續(xù)液體的流速，則在后續(xù)液體的推動(dòng)下被迫反方向向軸心方向流動(dòng)，移動(dòng)至轉(zhuǎn)鼓中心的進(jìn)液管周圍，并連續(xù)被排出。這樣，固體和液體就在碟片間的隙道流動(dòng)的過(guò)程中被分開(kāi)。,碟式離心機(jī),碟式分離機(jī)可以完成兩種操作： 液-固分離:即低濃度懸浮液的分離，稱澄清操作； 液-液(或液-液-固）分離: 即乳濁液的分離，稱分離操作。,碟式離心機(jī),,A

27、-供料 B-澄清產(chǎn)品出口 C-固體出口D-廢料去滅菌工序 E-蒸汽 F-儀表用空氣 G-無(wú)菌水 H-沖洗水 I-生產(chǎn)水補(bǔ)給水 J-生產(chǎn)水，排放水K-生產(chǎn)水出口L-夾套冷卻水，進(jìn)口M-夾套冷卻水，出口 N-軸封水O-排風(fēng) P-排水Q-冷凝水去滅菌工序,1-離心機(jī) 2-控制裝置 3-電動(dòng)機(jī)起動(dòng)器 4-固體貯罐 5-廢料貯罐 6-隔膜閥 7-球閥 8-氣動(dòng)隔膜閥9-止回閥 10-針閥 11-

28、空氣減壓閥 12-恒壓閥 13-取樣旋塞14-恒流閥 15-凝汽閥 16-無(wú)菌空氣過(guò)濾器 17-觀察鏡 18-壓力指示器(氣壓計(jì)) 19-流量計(jì) 20-溫度傳感器 21-液面?zhèn)鞲衅?碟式離心機(jī)適合于細(xì)菌、酵母、放線菌等多種微生物細(xì)胞懸浮液及細(xì)胞碎片懸浮液的分離。它的生產(chǎn)能力較大，最大允許處理量可達(dá)300m3／h，一般用于大規(guī)模的分離過(guò)程。,碟式離心機(jī),蒸發(fā)，萃取，沉淀以及膜分離等方法（1）蒸發(fā),外循環(huán)式真空蒸發(fā)器,

29、三效降膜式蒸發(fā)器,2.初步分離,有機(jī)溶劑萃?。涸诳股氐纳a(chǎn)中占有重要的地位。利用萃取法提取某些酯溶性的抗生素，具有質(zhì)量好，收率高速度快等優(yōu)點(diǎn)。,離心萃取機(jī),（2）萃取,有機(jī)溶劑萃取的不足： 許多蛋白質(zhì)都有極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑 ； 蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變性失活。,雙水相萃?。?用兩種不相溶的高聚物，如聚乙二醇和葡聚糖，進(jìn)行萃取，而不用常規(guī)的有機(jī)溶劑為萃取劑。其特點(diǎn)是兩相內(nèi)均含水高于75%

30、，故稱雙水相。 該法得到的雙水相可用傾析法和離心法分離。然后再用超濾法等提取目的產(chǎn)物和回收高聚物。,雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)使固液分離和純化兩個(gè)步驟同時(shí)進(jìn)行，一步完成；適合熱敏物質(zhì)的提取，主要是胞內(nèi)酶；親水性聚合物加入水中，形成兩相，在這兩相中，水分都占大比例（85～95％），這樣生物活性蛋白質(zhì)在兩相中不會(huì)失活，且以一定比例分配于兩相中。,雙水相的形成,如兩種聚合物間存在強(qiáng)的吸引力，則它們結(jié)合后存在于一相中；如兩種聚合物間

31、有斥力，即某種分子希望在它周圍的分子是同種分子而不是異種分子，達(dá)到平衡后會(huì)形成兩相，兩種聚合物分處一相。加入鹽分，由于鹽析作用，聚合物與鹽類溶液也能形成兩相。,目前已知的胞內(nèi)酶約2500種，但投入生產(chǎn)的很少。原因之一是提取困難。胞內(nèi)酶提取的第一步系將細(xì)胞破碎得到勻漿液，但勻漿液黏度很大，有微小的細(xì)胞碎片存在，欲將細(xì)胞碎片除去，過(guò)去是依靠離心分離的方法，但非常困難。雙水相系統(tǒng)可用于細(xì)胞碎片以及酶的進(jìn)一步精制。,雙水相萃取法常用于胞內(nèi)酶

32、提取。,雙水相萃取的應(yīng)用,用雙水相萃取胞內(nèi)酶，PEG/鹽系統(tǒng)應(yīng)用的較廣泛。通常將目的蛋白質(zhì)分配在上相（PEG），而細(xì)胞碎片分配在下相（鹽），便于離心分離。,雙水相提取胞內(nèi)酶的具體操作：,萃?。哼m量的細(xì)胞勻漿液與雙水相體系（一般為PEG/鹽）混合。上下相的分離：在萃取達(dá)到平衡后，就必須使上下相分離。有兩種方法：重力沉降和離心分離。多聚物的分離：當(dāng)目的蛋白是分配在PEG富集的上相中，相與相分離后，在上相中加入鹽，形成新的雙水相體系，在適

33、當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)重新被萃取進(jìn)入鹽相，而大量的PEG得到回收，鹽相中殘余的PEG可用超濾或透析除去。,,三步雙水相萃取流程圖,要成功地運(yùn)用兩水相萃取的方法，應(yīng)滿足下列條件：欲提取的酶和細(xì)胞應(yīng)分配在不同的相中；酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時(shí)，經(jīng)過(guò)一次萃取，就能得到高的收率；兩相用離心機(jī)很容易分離。,,(3)沉淀： 降低蛋白質(zhì)溶解度，如等電點(diǎn)沉淀、鹽析等。,(4) 膜分離： 膜分離是基于一

34、種半透性薄膜，使溶液中的某些組分通過(guò)，而阻止或截留其它組分的分離方法。它包括反滲透法(Reverse Osmosis)和超濾法(Ultrafiltration)。,依據(jù)物質(zhì)粒度大小這一幾何特性的差異，來(lái)分離物質(zhì)，而不必像萃取、沉淀法中那樣，需要加入其它物質(zhì)(溶劑、鹽類)，也不必像蒸發(fā)那樣，需要加熱。因此，使用膜分離法分離，產(chǎn)品的損失很少。,膜分離法的優(yōu)點(diǎn),若干生物物質(zhì)的粒度特征,滲透和滲透壓,1885年, Van’t Hoff滲透壓定律

35、： ?? ? ?·R·T·?Ci 滲透是在膜兩邊滲透壓差- ??的作用下的溶劑流動(dòng)；而反滲透、超濾是在一外加壓力差 ?P > ?? 的作用下, 溶劑逆向流動(dòng)。,,當(dāng)某溶液與某純?nèi)軇┲g被一半透性薄膜隔開(kāi)時(shí)，由于系統(tǒng)中的滲透壓作用，純?nèi)軇?huì)通過(guò)膜層而進(jìn)入溶液相，此即為滲透現(xiàn)象。 如果在溶液上方施加壓力，溶劑滲透的速率便減??；當(dāng)?P 等于滲透壓時(shí)，滲透即停止。如果進(jìn)一步增加外壓

36、，當(dāng)?P 超過(guò)滲透壓”時(shí)，純?nèi)軇┍惴聪驖B透，即從溶液滲向純?nèi)軇?，這就是反滲透。反滲透的結(jié)果，將使溶液被濃縮。,滲透和反滲透,滲透與反滲透,用雙級(jí)反滲透設(shè)備除鹽的技術(shù)稱為兩級(jí)反滲透技術(shù)，兩級(jí)反滲透裝置可除去原水中99%以上的鹽份。,超濾通常使用孔徑較大的薄膜，截留的分子也較大。由于超濾允許較大的分子通過(guò)，既有濃縮的作用，又有純化的作用。如在酶制劑的制備過(guò)程中，即可用超濾法同時(shí)實(shí)現(xiàn)濃縮和純化。 反滲透則只允許溶劑通過(guò)，

37、較大的鹽類分子也有可能被截留，所以，反滲透只起濃縮作用。,超濾：,常見(jiàn)膜分離裝置,中空纖維超濾器,超濾裝置是以毛細(xì)管式超濾膜為核心設(shè)計(jì)制造的，其超濾膜微孔可達(dá)0.01微米（十萬(wàn)分之一毫米）以下，因而過(guò)濾精度高。,,生化產(chǎn)品提純，常用層析法(Chromatography)。所謂層析法，是在一根層析柱內(nèi)，填充以某種特殊的載體物質(zhì)(稱固定相)；含有被分離物質(zhì)的混合物(稱流動(dòng)相)，則流經(jīng)層析柱。由于混合物內(nèi)各種物質(zhì)在某種性質(zhì)上的差異，導(dǎo)致與固定

38、相之間產(chǎn)生的結(jié)合力不同，因此，各種物質(zhì)在柱內(nèi)的停留時(shí)間也就不一樣，它們將依次流出層折柱，據(jù)此，便可把它們分離。,3. 產(chǎn)品提純,吸附層析法：利用各種物質(zhì)與固定相之間的吸附力差異離子交換層析法：利用各種物質(zhì)帶電特性的差異分子篩層析法：利用各種物質(zhì)的幾何大小特性的差異親和層析法：利用物質(zhì)在生物特性方面的差異,層析種類,層析分離，多數(shù)是分批操作，但近年來(lái)，已出現(xiàn)了小規(guī)模的連續(xù)層析裝置。 見(jiàn)下圖：,層析的裝置,生產(chǎn)

39、時(shí)，料液在緩慢旋轉(zhuǎn)著的環(huán)狀層析柱頂端的某點(diǎn)加入．截流溶掖則在頂端的其它各點(diǎn)加入。對(duì)具有較大k值的組分言，因它通過(guò)層析柱較饅，故在它流出柱層并集于底部的收集管之前將沿著層析柱的環(huán)狀周邊旋轉(zhuǎn)一段較長(zhǎng)的距離(如區(qū)帶B)，而k值較小的組分，則很快就流入集留管(如區(qū)帶A)。如此，在不同的收集管內(nèi)，便可獲得不同的蛋白質(zhì)。該法的缺點(diǎn)是需要耗費(fèi)較多的截流溶液。,連續(xù)層析裝置示意圖,干燥：通常是生化產(chǎn)品分離的最后一步。由于很多生物產(chǎn)品，如味精、檸檬酸、酶

40、制劉、抗生素及單細(xì)胞蛋白等均是固體產(chǎn)品，故干燥操作在生化工業(yè)中十分重要。,4. 產(chǎn)品的最后分離,干燥的目的：去除物料中的水分，便于產(chǎn)品的保存和運(yùn)輸。 干燥的設(shè)備：工業(yè)生產(chǎn)中常用的干燥設(shè)備類型很多，但由于生物產(chǎn)品大多為熱敏性物質(zhì)，所以在對(duì)干燥設(shè)備的選用時(shí)須注意這一問(wèn)題。一般用于生物產(chǎn)品干燥的設(shè)備，必須是干燥時(shí)間不太長(zhǎng)，溫度不過(guò)高的設(shè)備。,（1）噴霧干燥,噴霧干燥的原理：利用不同的噴霧裝置，如噴嘴或轉(zhuǎn)盤(pán)等，將濃縮液或懸浮液噴成霧狀

41、，使形成具有巨大表面積的分散液滴，在干燥室內(nèi)緩緩沉降，并與熱空氣流發(fā)生強(qiáng)烈的熱、質(zhì)交換，迅速排除水分，在幾秒至幾十秒時(shí)間內(nèi)，便獲得干燥。成品以粉末狀沉降于干燥室底部，連續(xù)或間斷地排出。,逆流噴霧干燥器示意圖,逆流噴霧干燥器：是生物產(chǎn)品生產(chǎn)中常用的干燥裝置，它不僅是干燥， 還包括有造粒、蒸發(fā)及分離固體干燥物等一系列過(guò)程。,噴霧干燥由于干燥時(shí)間極短，避免了產(chǎn)品的破壞，故適合于抗生素、酵母粉和酶制劑等熱敏性物料的干燥。,氣流干燥器的原理：利用

42、顆粒在氣流中自由流動(dòng)的特性，使物料隨氣流一起流經(jīng)一段長(zhǎng)的管道，顆粒物料在與熱空氣一起流動(dòng)的過(guò)程中，由于熱空氣與濕物料充分接觸，水分汽化迅速，故待至干燥管道出口處，顆粒物料已被干燥。,（2）氣流干燥,近年來(lái)崛起的一種新型干燥設(shè)備。它的優(yōu)點(diǎn)與噴霧干燥器相同，也可在極短的時(shí)間內(nèi)(數(shù)秒鐘內(nèi))完成干燥操作，但它只適用于顆粒狀物料。,氣流式干燥器,待干燥物料經(jīng)加料器，均勻地進(jìn)入干燥器的底部?？諝獗还娘L(fēng)機(jī)抽吸，進(jìn)入空氣加熱器，被加熱至80一90℃，然

43、后進(jìn)入氣流干燥管的底部，與被干燥物料匯合。在經(jīng)過(guò)約10m高的干燥管后，物料已被干燥完畢，進(jìn)入旋風(fēng)分離器，把固體與廢氣分離。干燥的物料由分離器的底部排出，廢氣最后被排至大氣中。,,氣流干燥器的優(yōu)點(diǎn) 干燥時(shí)間短、干燥強(qiáng)度大、設(shè)備簡(jiǎn)單緊湊(僅一根數(shù)米至數(shù)十米長(zhǎng)的垂直管道)，即可把干燥、粉碎、運(yùn)輸、包裝等多道工作合于一道工序內(nèi)完成。適用于味精、檸橡酸、葡萄糖及四環(huán)素類抗生素等顆粒狀物料的干燥。,（3）沸騰干燥,沸騰干燥原理：是利

44、用流態(tài)化技術(shù)，使顆粒物料與熱氣流在流化狀態(tài)下密切接觸，而達(dá)到干燥的目的。 沸騰干燥與噴霧干燥和氣流干燥不同，物料在沸騰干燥器內(nèi)的停留時(shí)間較長(zhǎng)，容易引起物料破壞，因此不適宜于干燥熱敏性物質(zhì)，但可用于葡萄糖、味精和檸檬酸等較穩(wěn)定物料的干燥。,多層沸騰干燥器,臥式多室沸騰干燥器,如果被干燥物料的熱穩(wěn)定性很好，則可用鼓式干燥器。這種干燥器有兩個(gè)相向回轉(zhuǎn)的鼓，鼓內(nèi)通加熱蒸汽，當(dāng)溶液在被加熱的鼓面上流動(dòng)時(shí)，使汽化、干燥，最后，已干燥的物料

45、由刮刀連續(xù)地被刮下。,（4）鼓式干燥,鼓式干燥器示意,冷凍干燥原理：又稱升華干燥，是將濕物料或溶液在低溫下(-50~-10℃)凍結(jié)成固態(tài)，然后在高真空(1-0.001mmHg)下，將其中水分不經(jīng)液態(tài)直接升華成氣態(tài)，而達(dá)脫水、干燥的目的。這種干燥方法，處理溫度低，對(duì)熱敏性物質(zhì)特別有利，故適合于抗生素、維生素等生物制品的干燥。,（5）冷凍干燥,在冷凍干燥中，升華溫度一般為-35~-5℃，升華所需的熱量，可直接由所處理的物料供給，或者由外界提

46、供。目前冷凍干燥主要用于不能以結(jié)晶方法得到成品，而需直接由濃縮液通過(guò)干燥得到成品的場(chǎng)合。雖然噴霧干燥法亦可達(dá)到達(dá)一目的，但其成品質(zhì)量不論從效份、色澤，還是從易溶性等方面比較，均不如冷凍干燥佳。,實(shí)驗(yàn)室常用凍干設(shè)備,,三、典型生物產(chǎn)品的分離實(shí)例,在實(shí)際應(yīng)用中，生物產(chǎn)品分離過(guò)程中常用的幾種操作方法，是相互組合，配合使用的，最終使生物產(chǎn)品達(dá)到所規(guī)定的分離指標(biāo)。,典型生物化工品的生產(chǎn)工藝舉例,生產(chǎn)工藝過(guò)程,,右圖是胞內(nèi)酶的分離，在分離過(guò)程中，分

47、別使用了過(guò)濾、沉淀、滲析、超濾、層析、離心、勻漿及冷凍干燥等單元操作．,,,右圖是青霉素生產(chǎn)的流程，由圖表明，對(duì)青霉素的分離，需要使用過(guò)濾、蒸發(fā)、萃取、結(jié)晶、離心及冷凍干燥等操作。,,,右圖是乳酸的分離，它也使用了多種單元操作，致最終獲得要求的產(chǎn)品。,,,,,,,,,,,收率：88%～90% 其中等電部分～75%，離交部分～20%,消耗：NH4OH、600kg H2SO4 、250Kg HCl,三廢 ：>20 噸有機(jī)廢

48、水(酸、堿多)干固物～2噸,,收率：> 95%,消耗：25Kg HCl,三廢：2 噸有機(jī)廢水,生產(chǎn)每噸味精比較,,第三節(jié) 生化產(chǎn)品分離技術(shù)的發(fā)展,一、膜技術(shù)推廣的應(yīng)用二、親和層析的推廣應(yīng)用三、優(yōu)質(zhì)層析介質(zhì)的研究四、上游技術(shù)對(duì)分離技術(shù)的影響五、發(fā)酵與提取相結(jié)合,一、膜技術(shù)推廣的應(yīng)用,隨著膜本身質(zhì)量的改進(jìn)和膜裝置性能的改善．在生化產(chǎn)品分離過(guò)程的各個(gè)階段，將會(huì)越來(lái)越多地使用膜技術(shù)。 例如: 某公司在提取頭抱菌素c的過(guò)

49、程中，研究利用微濾進(jìn)行發(fā)酵液的過(guò)濾；利用超濾去除雜質(zhì)蛋白和色素；利用反滲透進(jìn)行濃縮，最后結(jié)合HPLC進(jìn)行精制，制得純度達(dá)93％的成品c,,二、親和層析的推廣應(yīng)用,利用生物親和力可使分離的選擇性大大提高，在下游加工過(guò)程的各個(gè)階段，都正在使用或有可能使用親和技術(shù)，除親和層析外，還有親和分配、親和沉淀、利用親和力的膜過(guò)濾等。利用單抗的免疫吸附層析，選擇性最理想，但介質(zhì)的價(jià)格太高，急需研究改進(jìn)。,,三、優(yōu)質(zhì)層析介質(zhì)的研究,色層分離中主要困難之一

50、是層析介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度差，以天然糖類為骨架的介質(zhì)，目前已研究出高交聯(lián)度或能與無(wú)機(jī)介質(zhì)相結(jié)合的產(chǎn)品。,,四、上游技術(shù)對(duì)分離技術(shù)的影響,生化工業(yè)從原料到產(chǎn)品是一個(gè)整體，上游技術(shù)必須考慮到下游提取的難易及成本。 例如，將原來(lái)是胞內(nèi)的產(chǎn)物變?yōu)榘猱a(chǎn)物(或使處于圍膜間隙)；在細(xì)胞中高水平的表達(dá)形成細(xì)胞內(nèi)的包涵體，在細(xì)胞破碎后即可在低離心力下沉淀，因而容易分離；利用基因工程方法，使尿抑胃素上接幾個(gè)精氨酸殘基，使其堿性增強(qiáng)，而易為陽(yáng)離子交換

51、劑所吸附等。,,五、發(fā)酵與提取相結(jié)合,在發(fā)酵過(guò)程中，把產(chǎn)物除去以避免反饋抑制作用 如：利用半透膜的發(fā)酵罐、在發(fā)酵罐中加入吸附樹(shù)脂等。,,碟式離心機(jī),碟式離心機(jī)是立式離心機(jī)的一種，轉(zhuǎn)鼓裝在立軸上端，通過(guò)傳動(dòng)裝置由電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)而高速旋轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有一組互相套疊在一起的碟形零件--碟片。碟片與碟片之間留有很小的間隙。懸浮液（或乳濁液）由位于轉(zhuǎn)鼓中心的進(jìn)料管加入轉(zhuǎn)鼓。當(dāng)懸浮液（或乳濁液）流過(guò)碟片之間的間隙時(shí)，固體顆粒（或液滴）

52、在離心機(jī)作用下沉降到碟片上形成沉渣（或液層）。沉渣沿碟片表面滑動(dòng)而脫離碟片并積聚在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)直徑最大的部位，分離后的液體從出液口排出轉(zhuǎn)鼓。碟片的作用是縮短固體顆粒（或液滴）的沉降距離、擴(kuò)大轉(zhuǎn)鼓的沉降面積，轉(zhuǎn)鼓中由于安裝了碟片而大大提高了分離機(jī)的生產(chǎn)能力。積聚在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的固體在分離機(jī)停機(jī)后拆開(kāi)轉(zhuǎn)鼓由人工清除，或通過(guò)排渣機(jī)構(gòu)在不停機(jī)的情況下從轉(zhuǎn)鼓中排出。,影響分配的系數(shù),聚合物的分子量聚合物的濃度鹽類pH值,分子量越小，蛋

53、白質(zhì)容易分配于富含該聚合物的相中。,當(dāng)接近分配的臨界點(diǎn)蛋白質(zhì)均勻分配于兩相中，分配系數(shù)接近1；成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽濃度的比例增加時(shí)，系統(tǒng)遠(yuǎn)離平衡點(diǎn)，此時(shí)兩相性質(zhì)的差別增加，蛋白質(zhì)容易趨向于某一極。,鹽濃度增加促使蛋白質(zhì)兩極分化,對(duì)物質(zhì)解離度影響,蒸 發(fā) 單效、多效,精 餾 簡(jiǎn)單、共沸、抽提、反應(yīng),萃 取 簡(jiǎn)單、分級(jí)、反應(yīng),吸 附

54、 變壓、變溫,結(jié) 晶 熔化、溶媒,膜,色 譜,,選取順序,物理分離 傾析、聚結(jié)、過(guò)濾、除沫,,方法選擇的基本原則,1)、盡可能簡(jiǎn)單、低耗、高效、快速。2)、分離步驟盡可能少。Why? A)、 φn -----------總回收率，λn ------------各單元回收率。分離步驟越多，回

55、收率越低；如φ10 = 0.9510 = 0.63，φ5 = 0.955 =0.77B)、分離步驟多，設(shè)備投入大，人員物資消耗大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。3)、避免相同原理的分離技術(shù)多次重復(fù)出現(xiàn)。比如，分子篩和超濾技術(shù)按分子量大小分離，重復(fù)應(yīng)用兩次以上，意義就不大了。,4)、盡量減少新化合物進(jìn)入待分離的溶液。 A)、引起新的化學(xué)污染； B)、蛋白質(zhì)的變性失活 5)、合理的分離步驟次序。

56、 原則是：先低選擇性，后高選擇性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。,設(shè)計(jì)前應(yīng)了解的信息,㈠在設(shè)計(jì)前，首先要掌握的產(chǎn)物物化性質(zhì)，主要包括：(1)、溶解度及影響因素，包括溫度、pH值、有機(jī)溶劑和鹽等；(2)、分子量和分子形狀。對(duì)于高分子物質(zhì)非常有意義；(3)、沸點(diǎn)和蒸汽壓。對(duì)于熱穩(wěn)定的小分子物質(zhì)非常有意義；(4)、極性大?。?5)、分子電荷及影響因素，包括pH值和鹽等；(6)、功能團(tuán)。功能團(tuán)為萃取劑和特