第九章微生物遺傳與變異資料

1、第九章 微生物遺傳與變異,通過本章的學習，要求掌握：1、細菌基因重組的原理和方法。2、真菌基因重組的原理和方法。3、微生物誘變育種的原理和方法。重點：細菌的基因重組難點：低頻轉導，高頻轉導，準性生殖,微生物是理想的遺傳學研究材料：①物種及代謝類型的多樣性；②個體體制簡單，營養(yǎng)體多為單倍體，基因組??；③繁殖快，易于累積不同的最終代謝產物及中間代謝物；④菌落形態(tài)特征的可見性與多樣性；⑤環(huán)境條件對微生物群體中各個體作

2、用的直接和均勻；⑥易變異、易得到營養(yǎng)缺陷型突變株；⑦一般都有相應的噬菌體；⑧存在著處于進化進程中的多種原始方式的有性生殖類等。,基因組genome：一種生物的全套基因。表現(xiàn)型phenotype：生物可見的或可測定的性狀遺傳型genotype：決定生物表現(xiàn)型的遺傳因子同樣遺傳型的生物在不同外界條件下，會顯現(xiàn)不同表現(xiàn)型，但遺傳型并非改變，這種變異為非遺傳性變異，只能稱適應或飾變(modification)；只有遺傳型改變，從而引

3、起表型變化才稱為變異，它發(fā)生在基因水平上，可以遺傳給子代。,Serretia marcescens在25℃下培養(yǎng)時，會產生一種深紅色的靈桿菌素，把菌落染成鮮紅色?？墒牵斉囵B(yǎng)在37℃下時，群體中所有細胞都不產色素。如果重新降溫至25℃，產色素能力又得到恢復。,第一節(jié) 生物遺傳信息的載體,證明DNA是遺傳物質的經(jīng)典實驗①1928年，F(xiàn). Griffith；1944年O. T. Avery 肺炎鏈球菌（Streptococcus pn

4、eumoniae）轉化試驗。②1952年，A. D. Hershy、M. Chase的噬菌體感染實驗。③1956年，H. Fraenkel-Conrat的TMV拆開和重建實驗。,Griffith的轉化實驗,,轉化因子的本質的闡明,Hershey-Chase的噬菌體實驗用35S和32P去分別標記大腸桿菌，然后再用T2噬菌體感染，即可分別得到標有35S和T2和32P的T2噬菌體。把標記噬菌體與其宿主大腸桿菌混合，經(jīng)短時間(如10 m

5、in)保溫后，使T2完成吸附和侵入過程。在組織搗碎器中劇烈攪拌，以使吸附在菌體外表的T2蛋白外殼脫離細胞并均勻分布。進行離心沉淀，再分別測定沉淀物和上清液中的同位素標記。,結果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部的32P都和細菌一起出現(xiàn)在沉淀物中，而幾乎全部33S都在上清液中。這意味著噬菌體的蛋白外殼經(jīng)自然分離后仍留在細胞外部，只有核酸芯子才進入宿主體內；同時，由于最終能釋放出一群具有與親代同樣蛋白外殼的完整的子代噬菌體，說明只有核酸才是其全部遺體信

6、息的載體。后來通過電子顯微鏡的觀察也證實了這個論點。,TMV重建實驗,遺傳物質在細胞中的存在方式①真核生物DNA分子與組蛋白結合構成染色體，每條染色體有單一線性雙鏈DNA分子。一個真核生物細胞內有多條染色體（脈孢菌7條，人23條）。高等生物中有2至多套染色體（動物2倍，水稻4倍），真菌有雙倍體，但多數(shù)微生物是單倍體。真核細胞核物質外有核膜包圍，形成完整細胞核。,②原核生物DNA不與組蛋白結合，染色體僅由一條DNA組成，DNA

7、為共價閉合環(huán)狀雙鏈，一個細胞內只有一條染色體（單倍體haploid）。無核膜膜包圍，只在細胞中央形成核區(qū)。③質粒plasmid原核生物中，除染色體以外，能夠自主復制的共價閉合環(huán)狀DNA分子。它們攜帶少量遺傳基因，決定細胞的某些性狀，并非細菌生活必需。,DNA的雙螺旋結構圖,遺傳信息的傳遞和基因表達基因geneDNA分子的一定區(qū)段，攜帶特定的遺傳信息，是具有自主復制能力的遺傳功能單位。遺傳信息通過DNA連上的核苷酸排列順序表現(xiàn)出

8、來。結構基因決定多肽形成的堿基順序稱結構基因，一個結構基因表達后，產生一個多肽；即“一個基因一個酶”。調節(jié)基因對結構基因起調節(jié)控制作用的稱調節(jié)基因。操縱子學說,基因的表達以DNA為模板，通過RNA聚合酶轉錄出mRNA，然后將mRNA包含的堿基順序在核糖體中翻譯成相應氨基酸序列的多肽。①轉錄（transcription）雙鏈DNA→單鏈，以其中一條為模板→互補mRNA②翻譯(translation)mRNA →多肽,第

9、二節(jié) 原核微生物的基因重組克隆clone不經(jīng)過有性細胞的結合，由體細胞發(fā)育成新個體，即無性繁殖?；蛑亟Mgene recombination兩個不同來源的遺傳物質進行交換，經(jīng)過基因的重新組合，形成新的基因型的過程。重組獲得的后代具有新的基因組合，表現(xiàn)出不同于親本的新性狀。原核微生物沒有有性生殖，其基因重組通過轉化、接合、轉導方式進行。,,,轉化Transformation 定義不經(jīng)其它媒介，來自供體（donor）的D

10、NA片段或質粒DNA直接進入受體菌（recipient或receptor） ，并在受體中復制、表達的過程。轉化過程①受體細胞呈現(xiàn)感受態(tài)，即容易接受外源DNA的生理狀態(tài)。②外源DNA與感受態(tài)細胞結合并被吸收。③外源DNA整合到受體菌中，成為受體菌染色體的一部分。轉染 transfection指用提純的病毒核酸去感染其宿主細胞或原生質體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。,轉化示意圖,轉導transduction 定義通過完全

11、缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把一個供體細胞的 DNA 片段轉移到另一個受體細胞中，并使后者發(fā)生遺傳變異的過程。通過轉導獲得供體細胞部分遺傳性狀的重組受體細胞，稱為轉導子（transductant）。攜帶供體部分遺傳物質（DNA 片段）的噬菌體稱為轉導噬菌體或轉導顆粒。,1952 年Zinder 和 Lederberg 在驗證Salmonella typhimurium是否也存在接合現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)了轉導現(xiàn)象。S. typhimurium

12、：LT22A (trp-)； LT2(his-)LT22溶原性→噬菌體P22→ 感染LT2（非溶原性）→可能釋放帶trp+的P22→LT22A (trp-)→呈原養(yǎng)型。,普遍轉導(generalized transduction)噬菌體可誤包供體菌中的任何基因(包括質粒)，并使受體菌實現(xiàn)各種性狀的轉導完全普遍性轉導 complete transduction 形成了遺傳性穩(wěn)定的 轉導子(transductant),流

13、產普遍性轉導簡稱流產轉導(abortive transduction)，在許多獲得供體菌DNA片段的受體菌內，如果轉導DNA不能進行重組和復制，其上的基因僅經(jīng)過轉錄而得到了表達。 能在選擇性培養(yǎng)基 平板上形成微小菌 落成了流產轉導的 特點。,局限轉導specialized transduction當溶原菌群經(jīng)誘導后，其中極少數(shù)前噬菌體從宿主染色體脫落時產主錯誤切割，從而把宿主的某些基因（ λ前噬菌體位點兩端是

14、細菌染色體的gal＋和bio＋，故形成的轉導噬菌體通常帶有ga1＋或bio＋）整合到噬菌體的基因組上 ，當這樣的噬菌體侵染另一宿主菌時，噬菌體 DNA 與受體菌的 DNA 同源區(qū)段配對，通過雙交換而整合到受體菌的染色體組上，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性，而形成轉導子（缺陷溶源菌）。,λ噬菌體DNA的不正常切割,丟失了自身部分基因，并被同等長度的宿主基因所取代的噬菌體稱為缺陷噬菌體（defective phage）。如λdgal或

15、λdbio。低頻轉導（1ow frequancy transduction, LFT），形成轉導子的頻率很低，只有10-4~ 10-6 。 高頻轉導（high frequancy transduction, HFT ），形成轉導子的頻率很高, 理論上可達 50%。,高頻轉導是雙重溶源的結果： λ ─┐ │＋ E.coli k12 → [E.coli K12(λ/λdgal )F ] λdga

16、l ┘ ↓UV 轉導噬菌體（λgal）→ 轉導子菌落 輔助噬菌體（λ）→ 噬菌斑,溶源轉變(lysonenic conversion)當溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時，因噬菌體的基因整合到宿主的基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象。當

17、宿主喪失這一噬菌體時，通過溶源轉變而獲得的性狀也同時消失。溶源轉變與轉導有本質上的不同，首先是它的溫和噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；其次，這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的。溶源轉變的典型例子是不產毒素的白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae) 菌株在被β噬菌體感染而發(fā)生溶源化時，會變成產白喉毒素的致病菌株。,接合conjugation通過供體菌與受體菌間細胞相接觸而傳遞大段DNA的過程。1946年，Le

18、derberg和Tatum的E.coli k12營養(yǎng)缺陷型株混合培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)。E.coli k12兩個突變株①bio- met- the+ leu+②bio+ met+ the- leu-兩種菌混合培養(yǎng)后，出現(xiàn) 原養(yǎng)菌（bio+ met+ the+ leu+） 可在基本培養(yǎng)基上生長。,細菌接合現(xiàn)象研究得最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌是有性別分化的。決定它們性別的因子稱為F因子(即致育因子或稱性質粒)，呈超螺旋狀態(tài)，具

19、有自主的與染色體進行同步復制和轉移到其他細胞中去的能力。也可插入(即整合)到染色體組上；它既可經(jīng)過接合作用而獲得，也可通過一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、絲裂霉素C、硫酸十二酯鈉、亞硝基胍、利福平、溴化乙錠、環(huán)己亞胺和加熱等)的處理，而從細胞中消失。F因子的分子量為5×107。在大腸桿菌中，F(xiàn)因子的DNA含量約占總染色體含量的2%。,F 因子的存在方式及其相互關系,F+菌株 含F(xiàn)質粒，細胞表面產生性毛(s

20、ex pili)，與F-細胞相連，在接合后轉移DNA。 F-菌株 無F質粒，不 產生性毛，可 接受外來F質粒。,Hfr菌株高頻重組菌株（high frequency recombination）。與F-接合后，重組頻率比F+高幾百倍。在Hfr細胞中，存在與染色體特定位點相整合的F因子(產生頻率約10-5)。當它與F-菌株發(fā)生接合時，Hfr染色體在F因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變成線狀。整段線狀染色體轉移至F-細胞的全過程

21、約需100 min。在轉移時，由于斷裂發(fā)生在F因子中，所以必然要等Hfr的整條染色體組全部轉移完成后，F(xiàn)因子才能完全進入F-細胞。但轉移過程中斷，所以越在前端的基因，進入的機會就越多，故在F-中出現(xiàn)重組子的時間就越早，頻率也高。,F’菌株當Hfr菌株內的F因子因不正常切割而脫離其染色體組時，可形成游離的攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱F’因子。攜帶有F’因子的菌株，其性狀介于F+與Hfr之間，這就是初生F’菌株。初生F’菌株與F-菌

22、株接合，可使后者轉變成F’菌株，這就是次生F’菌株，它既獲得了F因子，又獲得了來自初生F’菌株的若干遺傳性狀。以這種接合來傳遞供體菌基因的方式，稱為F因子轉導(F-duction)、性導(sexduction) 。在次生的F’群體中，大約有10%的F’因子重新整合到染色體組上，而恢復成Hfr菌。,原生質體融合 通過人工的方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發(fā)生融合并產生重組體的過程稱為原生質體融合（protoplast fusio

23、n）。微生物細胞融合的研究開始于1976年。其一般原理和主要過程是：先準備兩個有選擇性遺傳標記的突變株，在高滲溶液中，用適當?shù)拿摫诿溉コ毎冢賹⑿纬傻脑|體離心聚集，并加入促融合劑PEG(聚乙二醇)促進融合，然后在高滲溶液中稀釋，涂在能使其再生細胞壁或進行分裂的培養(yǎng)基上，待形成菌落后，通過影印接種法，將其接種到各種選擇性培養(yǎng)基上，最后鑒定它們是否是重組子。,基因轉座 gene transposition轉座子的特征是在兩端有I

24、R序列 ，分兩類：Ⅰ型Compound transposons：兩端為IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。Ⅱ型Complex transposons：兩端為IR(30~50bp)，中間為轉座基因和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551。,第三節(jié) 真核微生物的基因重組 有性雜交 準性生殖 準性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種生殖方式，它可使同種生物

25、不同菌株的體細胞發(fā)生融合，不經(jīng)過減數(shù)分裂的方式而導致低頻率的基因重組并產生重組子。,粗糙脈孢菌的有性雜交,準性生殖：準性生殖包括下面四個過程①菌絲聯(lián)結，②異核體形成，③核配④體細胞交換和單倍體化四個階段。,第四節(jié) 微生物基因突變和誘變育種,基因突變突變（mutation）指DNA順序上核苷酸發(fā)生置換或其它順序上的改變。突變類型①堿基對置換substitution 轉換transition： 顛換tran

26、sversion：②移碼突變frame-shift mutant③染色體畸變chromosomal aberration deletion、duplication、insertion、translocation、inversion,基因突變表型形態(tài)突變型生化突變型營養(yǎng)缺陷型auxotroph；抗性突變型；抗原突變型致死突變型 條件致死突變型 其他突變型如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產物的種類和產量以及對某種藥物的依賴性

27、突變型等。,基因突變的特點不對應性自發(fā)性稀有性獨立性誘變性穩(wěn)定性可逆性 正向突變(forward mutation)回復突變 (back matation或reverse mutation）,基因突變的自發(fā)性和不對應性的證明一種觀點認為，突變的原因和突變的性狀間是相對應的，并認為這就是“定向變異”、“馴化”。另一種觀點認為，基因突變是自發(fā)的。實驗證明：1943年S. E. Luria與M. Dlbruck進行

28、了Fluctuation test。1949年H. B. Newcombe的Respreding plated incubacion。1952年J. Lederberg夫婦用Replica- plating結束了爭論。,,DNA的損傷及其修復光復活作用(photoreactivation) 切除修復作用(excision repair)。重組修復SOS修復,化學誘變,亞硝酸引起DNA的堿基轉換,5-BU尿嘧啶引起堿基的轉換,

29、微生物育種①自發(fā)突變育種breeding by spontaneous mutation 生產育種 定向培育②誘變育種breeding by induced mutation 用物理（X-ray、UV等）化學（吖啶、亞硝酸、堿基類似物）因素誘變育種，獲得突變機率提高。,,基因工程gene engineering是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質--DNA 大分子提取出來，在離體條件下用適當?shù)墓ぞ呙?/p>

30、進行切割后，把它與作為載體(vector)的 DNA 分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源遺傳物質在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術。,過程①基因分離：②體外重組：外源DNA與載體連接③載體傳遞：導入受體，使外源DNA在受體中表達④復制、表達⑤篩選、繁殖：對重組后的大量重組子性狀進行篩選，從中選出所需性狀重組子，并使之穩(wěn)定繁殖。,微生物在基因工程中的

31、作用： 微生物作為克隆載體； 微生物生產基因工程工具酶； 1、限制性核酸內切酶 2、DNA連接酶 微生物作為克隆載體的宿主 ； 1、原核生物宿主 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 2、真核生物宿主 釀酒酵母 微生物作為表達載體。,DNA的體外擴增 穆利斯發(fā)明了聚和酶鏈式反應（polymerase chain reacti