基于RAD測序技術的單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)微衛(wèi)星標記的開發(fā)及5個地理群體遺傳結構分析.pdf

1、單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)是一種在我國黃、渤海海區(qū)新興的海水養(yǎng)殖經濟物種，其肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有極其巨大的經濟價值。但隨著過度捕撈以及環(huán)境破壞，單環(huán)刺螠資源已經呈現(xiàn)衰退趨勢，單環(huán)刺螠市場價格也不斷攀升。人工養(yǎng)殖以及有計劃的增殖放流迫在眉睫。雖然在山東地區(qū)人工育苗已經有所突破，但其地理種群遺傳分析與遺傳結構差異方面的研究還未曾報道，而發(fā)展的日趨成熟的微衛(wèi)星標記輔助育種技術為水產養(yǎng)殖品種的人工良種選育以及快速繁育工

2、作提供了可行而有效的工具。本研究基于RAD（restriction association site DNA）高通量測序法短時間獲得大量單環(huán)刺螠微衛(wèi)星序列，經過層層篩選，最終開發(fā)出22對高多態(tài)性微衛(wèi)星標記。進而利用這些微衛(wèi)星標記對黃渤海海區(qū)5個野生地理群體（山東省煙臺市YT、山東省濰坊市WF、山東省青島市QD、河北省秦皇島市QHD、遼寧省大連市DL）進行群體遺傳結構的分析和評估。
　　1.單環(huán)刺螠微衛(wèi)星標記的開發(fā)
　　首先，

3、利用改良后的酚—氯仿—異戊醇抽提法提取高質量的單環(huán)刺螠DNA，進而進行以Illumina HiSeq2500平臺的單環(huán)刺螠RAD文庫的構建，再對所得數據進行過濾和統(tǒng)計分析，本次測序共產生Raw data2.113G，過濾后的Clean data2.109G，測序質量情況為Q20>=96.76％、Q30>=92.22%，GC含量40.06%，而組裝后GC含量39.98%，兩者相差較小。從組裝后的序列片段中檢測到大量雜合單核苷酸多態(tài)性（SN

4、P）位點和少量的純合單核苷酸多態(tài)性位點，雜合度約為96.5%，從以上結果基本可以認為RAD測序的結果準確可靠。
　　本次測序共檢測到SSR序列1287個，其中測得三核苷酸微衛(wèi)星為818個，數量最多，約占總數的63.56%。為微衛(wèi)星序列長度在18bp以上的序列設計引物，挑選微衛(wèi)星序列長度在24bp以上的50個序列進行引物合成。并通過一個30個個體的秦皇島單環(huán)刺螠野生群體對這50對引物引物進行篩選，其中能穩(wěn)定擴增出清晰目的條帶的38對

5、，其中22對具有多態(tài)性。22個微衛(wèi)星序列全部為完美型（Perfect）。其中二核苷酸微衛(wèi)星5個(22.73%)，三核苷酸微衛(wèi)星14個(63.64%)，四核苷酸微衛(wèi)星2個(9.09%)，五核苷酸微衛(wèi)星1個(4.55%)。以QHD群體30個個體DNA為模板共檢測出等位基因多達234個，每個微衛(wèi)星位點的等位基因數（Na）在7—16之間，平均等位基因數(Na)為10.636；有效等位基因數（Ne）在4.369—13.534之間，平均有效等位基因

6、數為8.096個；平均觀測雜合度（Ho）和平均期望雜合度（He）的值分別為0.790和0.883。多態(tài)信息含量（PIC）平均值為0.854，UuS34位點的多態(tài)信息含量（PIC）最低，其值為0.736，UuS9位點最高，數值達到了0.921，22個微衛(wèi)星標記均為高多態(tài)性標記。
　　2.5個野生地理群體遺傳結構的分析
　　利用前文開發(fā)的22個高多態(tài)性微衛(wèi)星標記，對黃渤海海區(qū)5個野生地理群體進行遺傳結構的分析。結果表明：22個微

7、衛(wèi)星位點在5個群體中均表現(xiàn)為高多態(tài)性，以5個群體來看，每個標記檢測到等位基因數(Na)介于24—44之間，多態(tài)信息含量(PIC)介于0.921—0.967之間。5個群體總的平均有效等位基因數(Ne)范圍為6.629—8.850，平均觀測雜合度(Ho)和平均期望雜合度(He)范圍分別為0.790—0.912、0.851—0.896，DL群體的雜合度最大(He=0.8962)，WF群體的最小(He=0.8510)。平均遺傳分化指數(FST)

8、表明，群體分化水平處于中等分化水平，F(xiàn)ST值為0.0880—0.1136，WF群體分化最小，而DL群體分化最為明顯。這說明5個單環(huán)刺螠群體的遺傳多樣性較為豐富，其中DL群體的遺傳多樣性在5個群體中最高，而WF群體為最低；22個微衛(wèi)星標記中有12個標記在不同群體中出現(xiàn)顯著偏離Hardy—Weinberg平衡的現(xiàn)象；從Nei’s標準遺傳距離來看，YT和DL群體遺傳距離最遠，說明兩群體間親緣關系最遠；而YT和QD群體遺傳距離最近；DL群體與其

9、他群體均有較遠的遺傳距離。根據Nei遺傳距離采用UPGMA法進行圖聚類分析顯示煙臺群體先與青島群體聚為一支，再與秦皇島群體聚類，然后跟濰坊群體聚為一支，大連群體單獨聚為一支；遺傳距離模式(IBD)顯示單環(huán)刺螠群體的遺傳距離與地理距離間不存在顯著的線性關系。以上結果表明，黃渤海海區(qū)單環(huán)刺螠遺傳豐富度較多，但群體分化程度并不大，其中YT與DL群體遺傳距離最大，可能是由于黃渤海海區(qū)海流在一定程度上阻斷基因交流造成的。
　　本研究開發(fā)的微