實驗室儀器操作簡介-修改 1

1、分子生物學(xué)實驗室常用儀器設(shè)備簡介及操作,實驗一,實驗室主要儀器，設(shè)備的簡介及使用方法,微量移液器 高速臺式離心機 PCR儀 凝膠成像系統(tǒng) 電泳儀 恒溫氣浴搖床 超凈工作臺 滅菌鍋,微量移液器,微量移液器是連續(xù)可調(diào)的、計量和轉(zhuǎn)移液體的專用儀器，其裝有直接讀數(shù)容量計。 微量移液器有多種規(guī)格，在移液器量程范圍內(nèi)能連續(xù)調(diào)節(jié)讀數(shù)。 0.5～10μl 10～1

2、00μl 20～200μl 100～1000μl,常見規(guī)格,,量液的操作步驟：,,第一停點,,第二停點,A 保持微量移液器垂直，將按鈕壓至第一停點；B 微量移液器頭尖端浸入溶液，緩慢釋放按鈕；C 保持微量移液器垂直，將微量移液器頭與容器壁接觸，慢 慢壓下按鈕至第一停點；D 壓至第二停點把溶液完全釋放出；E 釋放按鈕回原狀。,1． 未裝吸嘴的微量移液器

3、絕對不可用來吸取任何液體。 2． 一定要在允許量程范圍內(nèi)設(shè)定容量，千萬不要將讀 數(shù)的調(diào)節(jié)超出其適用的刻度范圍，否則會造成損壞。 3． 不要橫放或倒拿帶有殘余液體吸嘴的移液器。 4． 不要用大量程的移液器移取小體積樣品。 5. 移液器使用完后，將刻度調(diào)到最大刻度，收藏。,量液操作注意問題：,臺式高速離心機,離心機的分類 低速：每分鐘幾千轉(zhuǎn) 高速：每分鐘1 ~ 3萬轉(zhuǎn) 超速：每分鐘3萬轉(zhuǎn)以上,低速：細(xì)胞等

4、大分子 高速：DNA，蛋白等 超速:  病毒，蛋白，細(xì)胞器等基因片段的分離、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實驗中都離不開低溫離心技術(shù) 本實驗室所用離心機:臺式高速離心機（ Thermo ），配有角式轉(zhuǎn)頭：24×1.5ml；極限轉(zhuǎn)速13000rpm ;臺式低溫高速離心機（sigma),極限轉(zhuǎn)速20000rpm。,離心機的功能：分離，純化,1、把離心機放置于平面桌或平面臺上，檢查離心機是

5、否 放置平穩(wěn)。2、將離心管對稱放入轉(zhuǎn)子內(nèi)，且要事先平衡。3、鎖緊門蓋。4、插上電源插座，按下電源開關(guān)。5、設(shè)置轉(zhuǎn)子號、轉(zhuǎn)速、時間： （常用，最高轉(zhuǎn)速為13000r/min，時間最長為20min）； 注意：對應(yīng)的轉(zhuǎn)子不可超速使用，否則對試管或轉(zhuǎn)子有損壞。6、當(dāng)轉(zhuǎn)子停轉(zhuǎn)后，打開門蓋取出離心管，關(guān)斷電源開關(guān)。,臺式高速離心機使用步驟,注意事項：1、離心機在運轉(zhuǎn)時，不得移動離心機，不要打開門蓋。2、安放離心機

6、的臺面應(yīng)堅實平整，四只橡膠機腳都應(yīng)與臺面接觸和均勻受力，以免產(chǎn)生振動。3、離心管加液要平衡，若加液差異過大運轉(zhuǎn)時會產(chǎn)生大的振動，此時應(yīng)停機檢查，使加液符合要求，離心試管必須對稱放入。4、若運轉(zhuǎn)時有離心試管破裂，會引起較大振動應(yīng)立即停機處理。5、離心機徹底停止后，才可開蓋，取樣。,PCR儀,PCR儀主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等許多領(lǐng)域，如基因分析、序列分析、進(jìn)化分析、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)等。,PCR儀，也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴增儀，

7、能使一對寡核苷酸引物結(jié)合到正負(fù)DNA鏈上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列DNA片段，它的每一循環(huán)包括DNA變性、復(fù)性、延伸三個反應(yīng)。,操作程序:,1）開機：打開電源，顯示主界面；2）創(chuàng)建程序：使用”create”輸入新程序（包括PCR循 環(huán)數(shù)，預(yù)變性、變性、復(fù)性、延伸的時間和溫 度），保存程序（包括用戶名和方法名）;3）放入樣品，蓋上蓋子;4）在所建用戶名下按“run”鍵，找到設(shè)定的程序，

8、按“start”鍵啟動程序;5）運行結(jié)束后按“stop”鍵停止運行，取出樣品，關(guān)閉電源。,1、預(yù)變性：可用94～95℃，2～10min,一般用 5min。 2、變性：一般用94℃，30s~2min,一般45s~1min。 3、退火：溫度自定，30s~2min。 4、延伸：72℃，對于(1kb=1min,每增加1kb加1min)。 5、循環(huán)數(shù)：一般25～35個循環(huán)(2,3,4步循環(huán)）。 6、最終延伸：72℃，5～15min。

9、7、保存：4℃，時間設(shè)為0。 8、END。,如何設(shè)置一個PCR程序：,FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng),系統(tǒng)簡介：,系統(tǒng)可以通過紫外/可見光分析裝置及透光掃描儀直接獲得核酸、蛋白質(zhì)凝膠電泳圖像。系統(tǒng)配置有SmartView生物電泳圖像分析軟件，可以進(jìn)行密度掃描、密度定量、分子量計算等電泳分析。此外，該系統(tǒng)含有多種圖像濾波器，可降低圖像的噪音，從而獲得較清晰的圖像。,操作步驟：,1）將電泳樣品放入分析裝置中2）打開電腦，運行Smar

10、t View 軟件，單擊“Import”鍵進(jìn)入 圖像獲取項目欄，選擇“獲取視頻圖像”鍵，進(jìn)行圖像采集3）選 擇紫外或可見光源，在圖像采集窗口中調(diào)節(jié)好圖像大 小、亮度及焦距4）單擊“采集圖像”鍵，根據(jù)圖像質(zhì)量選擇好優(yōu)化攝影時間 （一般情況下在12秒左右），即開始采集。,1、圖像采集,,,2、圖像保存 單擊“System 鍵”選擇“另保存圖像為”鍵，出現(xiàn)一個“圖像文件登記”窗口，輸入標(biāo)題，實驗人，實驗日期，

11、實驗摘要等信息，按“保存”鍵完成圖像文件登記，同時出現(xiàn)“另保存圖像為”窗口，輸入圖像名，保存圖像至桌面。 3、關(guān)閉操作系統(tǒng)（1）關(guān)閉紫外/可見光。（2）退出軟件界面。（3）關(guān)閉紫外與可見分析裝置的電源。,注意事項：,1、 不要戴“臟”手套觸摸電腦鼠標(biāo)、鍵盤及其它位置； 2、 不要戴“臟”手套觸摸倉門和燈箱電源開關(guān)； 3、 不要戴“臟”手套觸摸外接電源開關(guān)； 4、在圖像獲取過程中，若通過軟件打開紫外/可見光，則

12、 必須再通過軟件關(guān)閉，若通過紫外與可見分析裝置上 打開紫外/可見光，則從分析裝置上關(guān)閉，嚴(yán)禁互用， 導(dǎo)致紫外燈長亮。,電泳儀,DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）,操作程序：,1）電泳槽的兩個電極與電泳儀的直流輸出端連接（極 性不要接反）；,2）打開電源，設(shè)置參數(shù)（選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電 流范圍）；,3）按“啟動”啟動程序（輸出為高電壓，注意安全）；,4）電泳結(jié)束，

13、按“停止”鍵終止程序。,注意事項1、電泳儀工作時，禁止人體接觸電極、電泳物及其它可能帶電部分，也不能到電泳槽內(nèi)取放東西，以免觸電，同時要求儀器有良好接地端，以防漏電。2、儀器通電后，不要臨時增加或撥除輸出導(dǎo)線插頭，以防短路。3、由于不同介質(zhì)支持物的電阻值不同，電泳所通過的電流量也不同，其泳動速度及泳至終點所需時間也不同，故不同介質(zhì)支持物的電泳不要同時在同一電泳儀上進(jìn)行。4、使用過程中發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象，如較大噪音、放電或異常氣味，須立

14、即切斷電源，進(jìn)行檢修，以免發(fā)生意外。,使用及性能：搖床（振蕩器）廣泛用于對溫度和振蕩頻率有較高要求的細(xì)菌培養(yǎng)、發(fā)酵、雜交、生物化學(xué)反應(yīng)以及酶和組織研究等。實驗室常用的液體搖勻，微生物、細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)。,恒溫氣浴搖床,SHK-99-Ⅱ型臺式空氣恒溫?fù)u床,1）樣品瓶牢固放入彈簧夾中；2）接通電源開關(guān)，設(shè)定參數(shù)（溫度、時間、轉(zhuǎn)速等）；3）按啟動鍵啟動儀器，按暫停鍵可暫停托盤的旋轉(zhuǎn)；4）按下控制面板的電源鍵兩秒，顯示屏顯示消失，關(guān)閉電源

15、總開關(guān)。,操作程序：,超凈工作臺,使用及性能：超凈工作臺為分子生物學(xué)無菌操作提供可能，分為垂直送風(fēng)和水平送風(fēng)兩種。,超凈臺由三相電機作鼓風(fēng)動力，空氣通過由特制的微孔泡沫塑料片層疊合組成的“超級濾清器”后吹送出來，形成連續(xù)不斷的無塵無菌的超凈空氣層流，即所謂“高效的特殊空氣”，能夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，同時也不會妨礙采用酒精燈或本生燈對器械等的灼燒消毒。工作人員就在這樣的無菌條件下操作，可以保持無菌材料在轉(zhuǎn)移接種過程中不受污

16、染。,操作程序：,1）工作臺面上，不要存 放不必要的物品，以 保持工作區(qū)內(nèi)的潔凈 氣流不受干擾。2）操作時一定注意關(guān)掉 紫外，防止對實驗人 員造成傷害,注意事項：,滅菌鍋,使用及性能： 細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)以及核酸等有關(guān)實驗所用的試劑、器皿及實驗用具，應(yīng)嚴(yán)格滅菌； 對于經(jīng)過導(dǎo)入DNA重組分子的菌株，操作后必須進(jìn)行嚴(yán)格的高壓消毒滅活處理 。,1）開蓋：轉(zhuǎn)動手輪，使鍋蓋離開密封圈，添加蒸餾水剛沒

17、至板上；2）通電：打開控制面板上電源開關(guān)，若水位低則紅燈亮； 3）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過200mm×100mm×100mm為宜，各包裝之間留有間隙，利于蒸汽穿透，提高滅菌效果； 3）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，壓緊鍋蓋；4）滅菌：121℃， 20min；如為液體，液體必須裝在可耐高溫的玻璃器皿中，不宜超過2/3；5）滅菌結(jié)束，所有東西放入干燥箱干燥，排盡水氣。,操作程序：,1）如是

18、手動的滅菌鍋，滅菌過程中，應(yīng)注意排 凈鍋內(nèi)冷空氣，否則會影響滅菌效果。2）滅菌結(jié)束后，要等溫度降為“0”，才可打開滅 菌鍋鍋蓋；3）高壓蒸汽滅菌時，須保持高溫高壓，因此必 須嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作，否則易發(fā)生意外 事故。,注意事項：,瓊脂糖凝膠電泳的制備及核酸檢測,實驗二,帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳兩大類:自由界面電泳不需支持物，這類電泳目前已很少使用;而區(qū)帶電泳

19、則需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠-G薄層等，分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的是瓊脂糖凝膠電泳其優(yōu)點主要在于操作簡單、快速、靈敏。,一. 實驗?zāi)康?掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理;學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。,二. 實驗原理,瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在

20、外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。DNA分子量及構(gòu)型不同，其泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)。,溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強度大10倍以上，且熒光強度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5 ng以上的DNA。,附 注：,1．影響

21、DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素： 1) DNA分子大小        2) 瓊脂糖濃度：不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA    Agarose： 0.5%：1-30 kb；   0.7%： 0.8-12 kb；

22、 1.2%:  0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. 3) DNA構(gòu)象： 一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。,logN,1,V=,（V：遷移速率 N：堿基對數(shù)目）,,4) 所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電 壓成正比。5) 嵌入染料的存在：降低線

23、性DNA遷移率。6) 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的遷移率，無離 子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產(chǎn)熱厲害，熔 化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE， 1×TPE（均含EDTA  pH8.0）。,2．溴化乙錠（EB）：致癌劑，操作時應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。 3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（brom

24、ophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯青（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。,儀器 微量移液器，電泳儀，電泳槽，微波爐 試劑 瓊脂糖：1.0%； 電泳緩沖液（PH8.0）（50 × TAE 電泳緩沖液：取 Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml

25、， 0.25mol/L EDTA (pH8.0) 20ml ，加蒸餾水至100ml ） EB：5 µl / 100 ml TBE 電泳樣品：標(biāo)準(zhǔn)分子量核酸（DL2000）,三. 儀器和試劑,（1）制膠（以20 mL為例） a. 稱取0.2 g 瓊脂糖，加入20 ml 的1×TAE緩沖液搖勻； b. 微波爐加熱，至瓊脂糖完全溶解（要防止過熱溢出三角瓶）；

26、 c. 將制膠板放入制膠槽中，插入適當(dāng)?shù)氖嶙樱瑢⑷芙獾沫傊牵s50℃）加入2ul EB后，混勻，倒入其中，直至厚度為4～6 mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固(約30~ 45 min)； d. 小心垂直向上拔出梳子,以保證點樣孔完好,將膠板置于電泳槽中。,四. 操作步驟,（2）點樣：用微量移液器將5 µl DL2000 加入點樣孔。（3）電泳：打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3~5 V/cm(約100 V), 可見