細胞生物學(xué)教學(xué)主要內(nèi)容二

1、細胞生物學(xué)教學(xué)主要內(nèi)容二,,第一節(jié) 細胞周期概述,1 細胞周期；2 細胞周期時相與主要事件；3 細胞周期同步化.,1 細胞周期,細胞周期概述　　細胞周期指連續(xù)分裂的細胞從一次分裂中期到下一次分裂的中期所經(jīng)歷的過程。正常情況下，沿著 G1 S G2 M期運轉(zhuǎn)。 細胞周期經(jīng)歷的時間稱為細胞周期時間（Tc）。,從增殖的角度看，細胞可分為3類：①連續(xù)分裂細胞（周期中細胞）；在

2、細胞周期連續(xù)運轉(zhuǎn)。上皮組織的基底層細胞②靜止期細胞（G0期細胞）；③終端分化細胞。 分化程度很高，一旦生成后，則終生不再分裂。,◆靜止期細胞(Go細胞)： ?暫時脫離開細胞周期，停止分裂，去執(zhí)行一定的生物學(xué) 功能，給予適當(dāng)?shù)拇碳?，又可以重新進入細胞周期進行分裂增殖的細胞。如：肝細胞。 ?G0期是細胞周期以外的一個時期，不含在正常的細胞周 期之內(nèi)，去向未定。 ?向G0期細胞的轉(zhuǎn)變，多發(fā)生在G1晚期，而再進

3、入細胞周 期發(fā)生在G1初期。,③ 終端分化細胞,◆ 終末分化細胞?分裂程度很高，終生不在分裂，但保持生理機能的細胞。如：橫紋肌細胞。?G0期細胞和終末分化細胞的界限有時難以劃分，有的細胞過去認為屬于終末分化細胞，目前可能被認為是G0期細胞。,細胞周期,分為4個期：G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時間。S期(synthesis phase)，指DNA復(fù)制的時期。G2期(gap2)，指DNA

4、復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時間。M期又稱D期(mitosis or division)，細胞分裂開始到結(jié)束。,3 細胞周期同步化,細胞同步化是指自然的，或經(jīng)人為選擇或誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞周期同步化。前者稱為自然同步化，后者稱為人工同步化。1．多核體 如粘菌只進行核分裂，而不發(fā)生胞質(zhì)分裂，形成多核體。數(shù)量眾多的核處于同一細胞質(zhì)中，進行同步化分裂，使細胞核達108，體積達5~6cm。瘧原蟲也具有類似的情況。,細胞分裂的類型,無絲分

5、裂(amitosis)：又稱直接分裂，由Remark（1841）發(fā)現(xiàn)于雞胚血細胞，不涉及紡錘體形成及染色體變化 。有絲分裂(mitosis) ：又稱為間接分裂，由Fleming (1882)年首次發(fā)現(xiàn)于動物，Strasburger(1880)發(fā)現(xiàn)于植物。減數(shù)分裂(meiosis）：染色體復(fù)制一次，細胞連續(xù)分裂兩次。,第二節(jié) 細胞分裂,（一）有絲分裂過程,●前 期(prophase)●前中期(prometaphase)●中

6、期(metaphase)●后 期(anaphase) ●末 期(telophase)●胞質(zhì)分裂(Cytokinesis),概述,前期 前期的主要事件是：①染色質(zhì)凝縮，②分裂極確立與紡錘體開始形成，③核仁解體，④核膜消失。 前期最顯著的特征是染色質(zhì)通過螺旋化和折疊，變短變粗，形成光學(xué)顯微鏡下可以分辨的染色體，每條染色體包含2個染色單體。 早在S期兩個中心粒已完成復(fù)制，在前期移向兩極，兩對中心粒之間形成紡錘體微管

7、，當(dāng)核膜解體時，兩對中心粒已到達兩極，并在兩者之間形成紡錘體,前期(prophase) 標志前期開始的第一個特征是染色質(zhì)開始濃縮 (condensation)形成有絲分裂染色體(mitotic chromosome）,這種染色體由兩條染色單體 (chromatid)構(gòu)成。,前期①染色質(zhì)凝縮，②分裂極確立與紡錘體開始形成，③核仁解體，④核膜消失。,S期中心粒已完成復(fù)制，在前期移向兩極，兩對中心粒之間形成紡錘體微管，核膜

8、解體時，中心粒已到達兩極，并形成紡錘體。,紡錘體有三種微管結(jié)構(gòu)：①極體微管（polar mt）兩極間的微管，在紡錘體中部重疊，重疊部位結(jié)合有分子馬達 。②著絲點微管（kinetochore mt），是從著絲點到另一極的微管；③星體微管（astral mt），由中心粒放射出來的微管。植物沒有中心粒和星體，其紡錘體稱無星紡錘體。,有兩類馬達蛋白參與染色體和分裂極的分離，一類是動力蛋白（dynein），另一類是驅(qū)動蛋白（kinesin）

9、。 植物沒有中心粒和星體，其紡錘體叫作無星紡錘體，分裂極的確定機理尚不明確。,前中期(prometaphase),指由核膜解體到染色體排列到赤道面(equatorial plane)這一階段。紡錘體微管向細胞內(nèi)部侵入，與染色體的著絲點結(jié)合。著絲點處的分子馬達使染色體向微管的負端移動。,前中期核膜解體到染色體排列到赤道面(equatorial plane) 上。,在光鏡下可以看到，此時染色體也就是既向一極移動也向另一極移動，是以振

10、蕩的方式移向紡錘體中部的。其原因是姊妹染色單體的著絲點都結(jié)合有微管和分子馬達。,中期(metaphase),◆所有染色體排列到赤道板(Metaphase Plate)上， 標志著細胞分裂已進入中期.確保染色體正確排列在赤道板上機制：著絲粒微管動態(tài)平衡形成的張力,后期(anaphase),◆排列在赤道面上的染色體的姐妹染色單體分離產(chǎn) 生向極運動。,中期染色體排列到赤道面上。,后期指妹妹染色體單體分開并移向兩極的時期。分為后期

11、A、后期B兩個過程。,◆ 后期A：動粒微管去裝配變短，染色體產(chǎn)生兩極運動 后期B：極間微管長度增加，兩極之間的距離逐漸拉長，介導(dǎo)染色體向極運動,末期(telophase),◆染色單體到達兩極，即進入了末期（telophase）。,到達兩極的染色單體開始去濃縮◆核膜開始重新組裝 ◆Golgi體和ER重新形成并生長◆核仁也開始重新組裝，RNA合成功能逐漸恢復(fù), 有絲分裂結(jié)束,動物細胞胞質(zhì)分裂,胞質(zhì)分裂：雖然核分裂與胞質(zhì)分裂

12、（cytokinesis）是相繼發(fā)生的，但屬于兩個分離的過程，例如大多數(shù)昆蟲的卵，核可進行多次分裂而無胞質(zhì)分裂，某些藻類的多核細胞可長達數(shù)尺，以后胞質(zhì)才分裂形成單核細胞。,動物細胞胞質(zhì)分裂,(1) In animal cells (furrow),胞質(zhì)分裂(cytokinesis)開始于細胞分裂后期，在赤道板周圍細胞表面下陷，形成環(huán)形縊縮，稱為分裂溝(furrow)。分裂溝的位置與紡錘體極性微管和鈣離子濃度升高的變化有關(guān)。,收縮環(huán)（肌球

13、蛋白和肌動蛋白參與）,胞質(zhì)分裂開始時，大量肌動蛋白和肌球蛋白在中間體處組裝成微絲并相互組成微絲束，環(huán)繞細胞，稱為收縮環(huán)（contractile ring)。收縮環(huán)收縮，收縮環(huán)處細胞膜融合 并形成兩個子細胞.分裂溝位置的的確立，肌動蛋白聚集，收縮環(huán)形成，收縮環(huán)收縮，收縮環(huán)處細胞融合.,(2) In plant cells,與動物細胞胞質(zhì)分裂不同的是，植物細胞胞質(zhì)分裂是因為在細胞內(nèi)形成新的細胞膜和細胞壁而將細胞分開。,植物細胞末期近兩極

14、處紡錘絲消失，中間微管保留，并數(shù)量增加，形成成膜體。來自高爾基體囊泡沿微管轉(zhuǎn)運到成膜體中間。融合形成細胞板(cell plate)，囊泡的內(nèi)含物形成初生壁和中膠層，囊泡膜形成質(zhì)膜，融合留下的管道形成胞間連絲。,動粒與著絲粒,動粒（著絲點）是附在著絲粒上的結(jié)構(gòu)，每條中期染色體上有兩個動粒，分別位于著絲粒的兩側(cè)，分裂時進入子細胞，S期時動粒復(fù)制。,,電鏡下，動粒為園盤狀的結(jié)構(gòu)，分內(nèi)、中、外三層。動粒和著絲粒結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系緊密，常被稱為著絲

15、粒－動粒復(fù)合體。,1.減數(shù)分裂前間期的特點,◆S期持續(xù)時間較長◆S期僅復(fù)制全部DNA的99.7 ~99.9 ％ ,其余 的0.1 ~ 0.3 ％將在前期I的偶線期才復(fù)制。 ?5000 ~10000片段，長1000 ~5000bp ?L蛋白與DNA片段結(jié)合，阻止復(fù)制 ?DNA片段與減數(shù)分裂前期染色體配 對與重組有關(guān)。,特點：細胞僅進行一次DNA復(fù)制，隨后進行兩次分裂。意義：既有效獲得了父母雙方的遺傳物質(zhì)，保持

16、后代的遺傳性，又可以增加更多的變異機會，確保生物的多樣性，增強生物適應(yīng)環(huán)境變化的能力。,稱前減數(shù)分裂間期或前減數(shù)分裂期(premeiosis)。間期也可分為G1期、S期和G2期。G2期是有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期。減數(shù)分裂的S期時間較長，部分DNA（約0.3%左右）是在合線期合成的。,間期,分裂期,（一）減數(shù)分裂I1、前期I（持續(xù)時間較長）減數(shù)分裂的特殊過程主要發(fā)生在前期I ，通常分為5個時期：①細線期（leptoten

17、e ），②偶線期（zygotene ），③粗線期（pachytene），④雙線期（diplotene），⑤終變期（diakinesis）。,1）細線期：染色體呈細線狀，具有念珠狀的染色粒，端粒通過接觸斑與核膜相連。2）偶線期：亦稱合線期，是同源染色體配對的時期。概念：聯(lián)會復(fù)合體(synaptonemal complex， SC）二價體（bivalent）四分體（tetrad）。這一時期合成約0.3%左右的DNA，稱為Z-DNA。

18、3）粗線期：同源染色體的非姊妹染色單體間發(fā)生交換的時期；合成P-DNA，大小為100~1000bp，編碼一些與DNA點切和修復(fù)有關(guān)的酶類；合成減數(shù)分裂期專有的組蛋白，并將體細胞類型的組蛋白部分或全部的置換下來。4）雙線期：時間較長，聯(lián)會的同源染色體相互排斥、四分體清晰可見，開始分離，交叉開始端化(terminalization)。聯(lián)會復(fù)合體消失。,補充：植物細胞雙線期一般較短，許多動物卵細胞中雙線期停留的時間非常長。人的卵母細胞在五個

19、月胎兒中已達雙線期，而一直到排卵都停在雙線期，排卵年齡大約在12-50歲之間。魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及無脊椎動物的昆蟲中，雙線期的二階體解螺旋而形成燈刷染色體，這一時期是卵黃積累的時期。 5）終變期：二階體顯著變短。由于交叉端化過程的進一步發(fā)展，故交叉數(shù)目減少，通常只有一至二個交叉。RNA轉(zhuǎn)錄停止，核仁此時開始消失，四分體較均勻地分布在細胞核中，核被膜解體。,2、中期I （紡錘體裝配）3、后期I二價體的兩條同源染色體分開，分

20、別向兩極移動。同源染色體隨機分向兩極，染色體重組，人類染色體重組概率有223個。4、末期I5、減數(shù)分裂間期。 （二）減數(shù)分裂II可分為前、中、后、末四個四期，與有絲分裂相似。一個精母細胞形成4個精子；一個卵母細胞形成一個卵子及2-3個極體。,四、減數(shù)分裂與有絲分裂的比較,1.減數(shù)分裂發(fā)生在有性生殖的組織中，分裂后形成性細胞；有絲分裂發(fā)生在正在生長的組織中，分裂后形成體細胞。 2.減數(shù)分裂的前間期的S期時間長，并且僅合成99

21、.7％的DNA剩余的在合線期合成；有絲分裂的間期短，合成全部的DNA。 3.減數(shù)分裂的前期I變化復(fù)雜時間長，發(fā)生同源染色體的配對及非姐妹染色單體之間片段的交換與重組；有絲分裂中每條染色體獨立活動，不發(fā)生配對及交換現(xiàn)象。 4.減數(shù)分裂的中期I同源染色體的著絲點位于赤道板的兩側(cè)；有絲分裂的中期著絲點位于赤道板上。,減數(shù)分裂與有絲分裂的異同,5.減數(shù)分裂后期I同源染色體分離，而姐妹染色單體不分離；有絲分裂的后期著絲點分離，姐妹染色單體分離

22、成為兩條獨立的染色體。6.減數(shù)分裂的末期II形成四個1n的性細胞；有絲分裂的末期形成兩個2n的體細胞。7.減數(shù)分裂DNA復(fù)制一次，細胞連續(xù)分裂兩次；有絲分裂DNA復(fù)制一次，細胞分裂一次。8.減數(shù)分裂在遺傳性狀上有變化；有絲分裂前后親代與子代在遺傳性狀上無變化。,A. The cell-cycle control system triggers(觸發(fā)） the major processes of the cell cycle,B.

23、 The control system can arrest the cell cycle at specific checkpoints,C. The cell cycle control system is based on cyclically actived protein kinases---cyclin-dependent kinases (周期蛋白依賴的蛋白激酶Cdks). Engine molecules for c

24、ell cycle,第三節(jié) 細胞周期的調(diào)控 (Cell-Cycle Control),CDK,CDC2與細胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。CDC2又被稱為CDK1，可將特定蛋白磷酸化，促進細胞周期運行，又稱作細胞周期引擎。如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。在動物中已知7種CDK。均含有

25、一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。,CDK1的調(diào)節(jié)與活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。結(jié)合cyclin B的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。,M期CDK的激活,CDK1的調(diào)節(jié)與活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase,M

26、期CDK的激活,在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK activating kinase CAK)的作用下完成的。,細胞周期調(diào)控系統(tǒng)的主要作用,◆在適當(dāng)時候激活細胞周期各個時相的相關(guān)酶 和蛋白,然后自身失活(正調(diào)控)◆確保每一時相事件的全部完成(負調(diào)控) ◆對外界環(huán)境因子起反應(yīng)(如多細胞生物對增殖信號的反應(yīng)),第十

27、四章 程序性細胞死亡與細胞衰老（一）,2013-5-26,,一 動物細胞的程序性死亡,概念：體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下，由基因嚴格調(diào)控而發(fā)生的一種生理性細胞自殺過程，又稱程序性細胞死亡（programmd cell death．PCD）。,動物細胞的死亡方式主要包括3種 1 凋亡（Apoptosis） 2 壞死 (Necrosis) 3 自噬 (Autophage),定義：由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序

28、而導(dǎo)致的細胞死亡過程稱為細胞凋亡。,1.2 動物細胞凋亡過程中的形態(tài)學(xué)變化,（1）凋亡的起始 細胞膜變化： 細胞凋亡的特征是細胞首先變圓,隨即與鄰周細胞脫離,失去微絨毛,細胞膜完整；微絨毛、細胞突起和細胞表面皺褶消失；胞膜迅速發(fā)生空泡化（blebbing），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴張并與胞膜融合，形成膜表面的芽狀突起，稱為出芽（budding）。,,,（2）凋亡小體的形成,細胞膜內(nèi)陷將細胞自行分割為多個外有膜包裹、內(nèi)涵

29、物不外泄的細胞凋亡小體。,凋亡小體（apoposis boby）：由透亮空泡和不透光的濃密的核碎片兩部分組成。,（3）凋亡小體被清除,被吞噬細胞或鄰周細胞所識別、吞噬,或自然脫落而離開生物。不引起炎癥反應(yīng)和次級損傷。,1.3 細胞凋亡的生理病理意義：①確保正常發(fā)育、生長：清除多余的、失去功能價值的細胞（指趾間組織細胞）②維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損突變細胞，自身反應(yīng)細胞，衰老細胞③發(fā)揮積極的防御功能：感染病毒細胞凋亡，阻止病毒復(fù)制,2

30、 細胞壞死,特征：線粒體膨脹，細胞骨架降解，溶酶體釋放酶，細胞核內(nèi)染色質(zhì)沉淀靠近核膜邊，蛋白質(zhì)合成下降，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥反應(yīng),一般過程：因補體反應(yīng)或烈性病毒感染破壞了質(zhì)膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進入細胞，從而導(dǎo)致細胞吸水膨脹，最終破膜而死。,細胞凋亡與壞死的區(qū)別,———————————————————,———————————————————,———————————————————,壞死

31、 凋亡,1.性質(zhì),2.誘導(dǎo)因素,強烈刺激，隨機發(fā)生,較弱刺激，非隨機發(fā)生,3.生化特點,4.形態(tài)變化,5.DNA電泳,6.炎癥反應(yīng),7.凋亡小體,8.基因調(diào)控,被動過程，無新蛋白合成，不耗能,主動過程，有新蛋白合成，耗能,細胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細胞腫脹,胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮,彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀,DNA片段化（180-200bp），電泳呈“梯”狀條

32、帶,溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng),溶酶體相對完整，局部無炎癥反應(yīng),有,病理性，非特異性,生理性或病理性，特異性,無,有,無,3 細胞自噬,,自噬體（autophagosome)：細胞內(nèi)衰老的細胞器等被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的膜包裹而形成的小體。,細胞中出現(xiàn)大的雙層膜包裹的自噬泡，稱為自噬小體（autophagosome),雙層膜來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細胞質(zhì)中的膜泡。自噬小體中包裹著整個的細胞器和部分細胞質(zhì)，自噬小體與溶酶體融合后，內(nèi)含物被溶酶體中的

33、水解酶消化。,動物細胞為了維持細胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡，需要不斷降解功能失?；虿恍枰募毎Y(jié)構(gòu)，如各種蛋白，細胞器以及各種胞質(zhì)組分。通常，壽命較短的蛋白如調(diào)控蛋白等通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進行降解；而壽命較長的細胞結(jié)構(gòu)及蛋白則通過細胞自噬途徑，由溶酶體進行降解。,自噬作用對細胞的生命活動有什么意義?,酶系統(tǒng)的更新:細胞質(zhì)中某些暫時不需要的酶系統(tǒng), 需要通過自噬作用進行更新。 舊細胞器的清除:細胞器都有一定的壽命, 為了保證細胞正常的代謝活動

34、, 必須不斷地清除衰老的細胞器和生物大分子。很多生物大分子的半衰期只有幾小時或幾天。肝細胞中線粒體的壽命平均約10天左右。 參與細胞發(fā)育:如紅細胞發(fā)育成熟后, 所有的細胞器都要通過自噬作用被清除。 應(yīng)激反應(yīng):在細胞饑餓條件下, 自噬作用也特別強, 主要是為細胞提供能量, 維持細胞的生命活動。,4 細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),Caspase依賴性途徑Caspase 非依賴性途徑當(dāng)受到凋亡誘導(dǎo)因素作用，兩種途徑均會被激活！caspas

35、e依賴的細胞凋亡又包括三種方式：①受體介導(dǎo)的細胞凋亡（外源通路）；②線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡（內(nèi)源通路）；③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細胞凋亡（內(nèi)源通路）。,Caspase 依賴性細胞凋亡,途徑主要有兩條：通過胞外死亡受體信號激活細胞內(nèi)的凋亡酶caspase （外源途徑）；通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase（內(nèi)源途徑）。,(1)外源途徑,細胞表面的凋亡受體是屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的跨膜蛋白，它們包括Fas（Apo-1/CD9

36、5）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1和DR5/TRAIL-R2。其配體屬于TNF家族，目前已比較清楚的是Fas介導(dǎo)的細胞凋亡途徑。,Fas 基因介導(dǎo)的細胞凋亡機制,3 種機制: ①Fas 基因介導(dǎo)的細胞凋亡過程可能是三聚體形式FasL 配體和Fas 受體結(jié)合激活Fas, 被激活的Fas 通過死亡功能區(qū)之間的相互作用和FADD 受體蛋白結(jié)合,FADD 又通過它的MORT 結(jié)構(gòu)域, 同凋亡蛋白酶caspase 8結(jié)合,

37、 激活caspase 8 活性, 后者再去激活其他的caspase 蛋白酶。這樣, 通過這一級聯(lián)系統(tǒng)的凋亡信號傳遞作用, 最終導(dǎo)致細胞凋亡。,Fas具有三個富含半胱氨酸的胞外區(qū)和一個稱為死亡結(jié)構(gòu)域（Death domain，DD）的胞內(nèi)區(qū)。Fas的配體FasL（Fas ligand）與Fas結(jié)合后，F(xiàn)as三聚化使胞內(nèi)的DD區(qū)構(gòu)象改變，然后與接頭蛋白FADD（Fas associated death domain）的DD區(qū)結(jié)合，F(xiàn)ADD的

38、N端DED區(qū)（death effector domain）就能與Caspase-8（或-10）前體蛋白結(jié)合，形成DISC (death-inducing signaling complex )。,胞外區(qū),胞內(nèi)區(qū),FADD N端通過DED區(qū)（death effector domain）與Caspase-8前體蛋白和CAP3結(jié)合，引起caspase-8、10通過自身剪激活，它們啟動caspase的級聯(lián)反應(yīng)，使caspase-3、-6、-7激

39、活，這幾種Caspase可降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，最終導(dǎo)致細胞凋亡。,②Fas 介導(dǎo)的細胞凋亡還可能以神經(jīng)酰胺作為第二信使傳遞信號, 通過激活一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子最終激活共同信號傳遞通路, 引起細胞凋亡, 這一過程被稱為神經(jīng)鞘磷脂循環(huán)。③另外有絲分裂原蛋白激酶(MA PA )的兩個亞類JN K 和ERK 也可以傳遞Fas 的凋亡信號。,5 細胞凋亡的檢測,誘發(fā)因素,抑制因素,形態(tài)學(xué)觀察；生物化學(xué)檢測；分子生物學(xué)檢測；免疫

40、學(xué)檢測。,檢測手段,細胞凋亡的形態(tài)學(xué)分析,細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化主要表現(xiàn)為：細胞皺縮(cell shrinkage)，失去細胞連接(cell junction)，微絨毛(microvilli)消失，發(fā)泡(blebbing)，染色質(zhì)濃集并靠近核膜，形成沿核膜收縮的新月狀體(crescents)，形成凋亡小體(apoptotic body)等。,細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測方法,形態(tài)學(xué)簡單檢測方法,1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞

41、質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團塊狀，細胞表面有“出芽”現(xiàn)象。2、丫啶橙（AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區(qū)別壞死細胞有一定的幫助。4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微

42、絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。,2.DNA凝膠電泳法檢測DNA降解,DNA降解過程的特點：1. 發(fā)生于凋亡早期，由內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活引起2. DNA在核小體連接部位斷裂，產(chǎn)生180－200bp為最小單位的單體或寡聚體片斷3. DNA碎片可被細胞膜包裹，形成凋亡小體,,原理：凋亡細胞降解產(chǎn)生一系列規(guī)則的DNA片斷，其電泳結(jié)果呈

43、典型的“ 梯狀帶”(ladder)；而壞死或凋亡后壞死細胞的DNA分解是隨機的，產(chǎn)生的碎片分子量大小不一，在電泳時形成“ 涂片狀”(smear)。 普通瓊脂糖凝膠電泳、Southern blotting、放射自顯影(32PdATP或32PdCTP連接到DNA片斷的3’ 端),生化改變,特點：cysteine-containing aspartate-specific protease（含半胱氨酸的天門冬氨酸特異水解酶）

44、,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,和凋亡有關(guān)的兩個酶,作用：切割染色質(zhì)DNA,DNase,特點：Ca2+/Mg2+增強活性，Zn2+抑制其活性,Caspases,作用：滅活凋亡抑制物,水解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，形成凋亡小體,水解凋亡相關(guān)活性蛋白,使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD破壞細胞結(jié)構(gòu)，如Lamina，形成凋亡小體將調(diào)節(jié)區(qū)與催化區(qū)分離，使蛋白失活，如Gelsolin,Caspase 作用機理,Caspases家族簡介,199

45、3年Yuan從哺乳類細胞中發(fā)現(xiàn)第1個Ced-3同源分子，叫白細胞介素-1β轉(zhuǎn)換酶（Interleukin-1 β Converting Enzyme，ICE），Pro-ICE含404個氨基酸，分子量45KD。在一定形式下可自身催化產(chǎn)生20KD和10KD二個片段，聚合形成（p20）2(p10)2雜四聚體，為活化的ICE。到1998年底為止共發(fā)現(xiàn)有14個Ced-3同源分子，分別定名為Caspase1-14。,caspases蛋白酶半胱氨酸

46、蛋白酶家族，稱為caspases。Caspase可譯為胱冬肽酶家族，與線蟲CED-3同源的調(diào)控哺乳動物細胞凋亡的蛋白酶家族。體內(nèi)均以酶原（相對分子質(zhì)量30 000～50 000）形式存在，包括3個功能區(qū):N端區(qū)(抑制區(qū)域)、大亞單位（約20 000）、小亞單位（約10 000）死亡區(qū)域；被激活的過程相似，即通過功能區(qū)間特異位點的蛋白酶解，繼而以大小亞單位形式形成異源二聚體。,Caspases的分子的結(jié)構(gòu)特征,Caspases的分子均

47、具有下列的結(jié)構(gòu)特征：①以無活性的Pro-Caspases形式存在。②在Pro-Caspases的N端均含有一段P2-P27的前 區(qū)域（Prodomain）。③活性形式均是由2個大亞基（17~20KD）和2個小亞基（10~12KD）組成的雜四聚體。一分子Pro-Caspase只能分裂產(chǎn)生1個大亞基和1個小亞基 。④在大亞基的C端均含有QACXG（X=R.Q或G）的活性中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故 Caspa

48、se是屬于半胱氨酸蛋白酶類。,TUNEL法檢測TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)終末脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標記技術(shù)。原理：在TdT的作用下，帶有標記物的dUTP被連接在斷裂DNA3’末端，然后通過相應(yīng)的方法檢測標記物，從而判斷是否有凋亡發(fā)生。應(yīng)用范圍：石蠟包埋的組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細胞、組織中分離的細胞,ELISA法 原理：以抗組蛋白抗體包被微

49、孔板壁，加入標本，凋亡細胞的核小體可與抗體結(jié)合，再加入抗-DNA片斷-POD復(fù)合物，與核小體中的DNA片斷結(jié)合，最后加入POD顯色底物，以酶標儀測定光密度以進行定量分析。,細胞凋亡發(fā)生機制,1 氧化損傷2 鈣穩(wěn)態(tài)失衡 3 線粒體損傷,（一）氧化損傷機制,氧自由基可破壞機體正常的氧化/還原的動態(tài)平衡，造成生物大分子的氧化損傷，干擾正常的生命活動，形成嚴重的氧化應(yīng)激狀態(tài)——后果：誘導(dǎo)細胞凋亡。,氧化損傷引起細胞凋亡的依據(jù)：①各種氧化劑

50、（H2O2）可直接誘導(dǎo)細胞凋亡②抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可誘導(dǎo)細胞凋亡③抗氧化劑（VitE、胡蘿卜素等）可阻斷有氧化應(yīng)激背景的各種凋亡誘導(dǎo)因素（TNF-а、電離輻射）引起的細胞凋亡,①引起DNA損傷，激活P53基因②引起DNA損傷，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭輔酶Ⅰ(NAD)，消耗大量ATP③攻擊細胞膜不飽和脂肪酸，脂質(zhì)過氧化，細胞膜損傷或產(chǎn)生過氧羥基24碳四烯酸④激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶⑤細胞膜損傷

51、，Ca2+內(nèi)流增多及損傷線粒體，通透性增加膜電位改變⑥活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB、AP-1，加速凋亡相關(guān)基因表達,氧化損傷引起細胞凋亡的可能機制：,細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞凋亡依據(jù)：①各種凋亡刺激所引起的凋亡是鈣依賴過程②凋亡發(fā)生時胞漿Ca2+濃度顯著上升，并在隨后的一系列凋亡改變中起關(guān)鍵性作用（核酸內(nèi)切酶激活、需鈣蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的激活，細胞膜的空泡化）③鈣穩(wěn)態(tài)失衡參與多種凋亡相關(guān)疾病的發(fā)?。ㄉ窠?jīng)退行性疾?。?2 鈣

52、穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞凋亡,①激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈②激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化肽鏈間的酰基轉(zhuǎn)移酶，肽鏈間形成共價鍵，使細胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成③激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速凋亡相關(guān)基因表達④Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈舒展，暴露核小體之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點，有利于DNA內(nèi)切酶切割DNA,鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞凋亡的可能機制：,2 鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞凋亡,線粒體的改變：線粒體內(nèi)膜通透性增

53、大，線粒體內(nèi)膜跨膜電位（△ψm）下降，能量代謝水平顯著降低線粒體改變引起細胞凋亡依據(jù)：①抑制線粒體的三羧酸循環(huán)或呼吸鏈功能可誘導(dǎo)細胞凋亡②在細胞核出現(xiàn)凋亡改變之前，常先有線粒體內(nèi)膜跨膜電位（△ψm）下降③阻止線粒體通透性的改變，可防止細胞凋亡（Bcl-2）,3線粒體損傷,第四節(jié) 細胞衰老,1. 細胞衰老的概念一般指的是復(fù)制衰老，體外培養(yǎng)的正常細胞經(jīng)過有限次數(shù)分裂以后，停止分裂，細胞形態(tài)和生理代謝活動發(fā)生顯著改變的過程。這個

54、改變過程即老化過程。,19世紀 魏斯曼學(xué)說：有機體終究會死亡，因為組織不可能永遠能夠自我更新，細胞憑借分裂來增加數(shù)量的能力是有限的。,20世紀40-50年代Carrel和Ebeling 學(xué)說：細胞不死 通過培養(yǎng)雞心臟細胞無限增殖，使得這觀點卷土重來。后來，L系小鼠細胞和HeLa細胞系的建立，更鞏固了這種觀點。,,Hayflick界限（Hayflick limitation)細胞增殖能力和壽命是有限的 。 細胞

55、，至少是培養(yǎng)的細胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是著名Hayflick界限。,,二、細胞衰老的特征,（一）形態(tài)變化1 細胞核變化： 在衰老變化中細胞核結(jié)構(gòu)的最明顯變化是核膜內(nèi)折。電鏡檢測可見衰老細胞核形狀不規(guī)則、內(nèi)陷和斷裂。在體內(nèi)細胞中也觀察到核膜的不同程度的內(nèi)折，神經(jīng)細胞尤為明顯，這種內(nèi)折隨年齡增長而增加，最后可能導(dǎo)致核膜崩解。染色體固縮化是衰老細胞核中另一個重要變化。

56、在衰老細胞中，細胞核固縮，還常常出現(xiàn)核內(nèi)容物，核質(zhì)染色加深，核的細致結(jié)構(gòu)逐漸消失，核仁也發(fā)生明顯的變化。,2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化在衰老細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列變得無序，膜腔膨脹擴大甚至崩解，膜面上核糖體數(shù)量減少。3 衰老過程中線粒體的變化 多數(shù)研究工作表明，細胞中線粒體的數(shù)量隨著年齡的增大而減少，而其體積則隨著年齡的增長而增大。衰老的神經(jīng)元，肝臟細胞和肌細胞的線粒體數(shù)目減少，但體積增大。同時，線粒體的結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，腫脹空泡化，內(nèi)部嵴

57、大大減少。線粒體崩解是細胞衰老變化的重要標志。,線粒體變化主要是自由基損傷的結(jié)果，因為線粒體的呼吸鏈是損傷性自由基的發(fā)源地。線粒體DNA成為自由基的主要攻擊目標，使線粒體DNA呈逐漸減少或使線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物逐漸減少，直接影響與線粒體呼吸和能量轉(zhuǎn)換過程有關(guān)的蛋白質(zhì)的合成，造成ATP合成和細胞能量供應(yīng)不足，引起細胞功能紊亂，直到細胞死亡。 4致密體的產(chǎn)生 由溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化而來。,5 膜系統(tǒng)的變化膜相 年輕的功能

58、健全的細胞的膜相是典型的液晶相，這種膜的脂雙層比較柔韌，脂肪酸鏈能自由移動，每個脂質(zhì)分子與起想林分子見的文職交換極其頻繁，埋藏于其中的蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)出最大的生物學(xué)活性。細胞間間隙連接 衰老細胞中減少。使得細胞間代謝協(xié)作減少了。細胞膜P面的膜內(nèi)顆粒 衰老細胞中明顯減少。這這種變化反映了衰老細胞中膜內(nèi)顆粒在膜平面上進行側(cè)向運動能力的喪失。,小 結(jié),（二）分子水平的變化,1. DNA：復(fù)制與轉(zhuǎn)錄受阻，端粒D

59、NA、mtDNA缺失。DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。2.  RNA：含量降低。3. 蛋白質(zhì)：含成下降，發(fā)生修飾、交聯(lián)。4.  酶分子：活性中心被氧化，金屬離子丟失，酶分子的二級結(jié)構(gòu)，溶解度，等電點發(fā)生改變，酶失活。5. 脂類：不飽和脂肪酸被氧化。,二 衰老過程中分子水平總體改變情況,細胞衰老的主要特征：,1、細胞內(nèi)水分減少，新陳代謝減慢2、有些酶的活性降低3、細胞內(nèi)的

60、色素逐漸積累，信息傳遞受阻4、細胞呼吸減慢，核增大，染色質(zhì)收縮，染 色加深。5、細胞膜通透性改變，運輸功能降低。,細胞衰老的分子機制,1 遺傳學(xué)派觀點：（1）端粒和端粒酶（2）基因?qū)W說2 差錯學(xué)派觀點（1）氧化損傷；（2）代謝廢物積累,差錯學(xué)派觀點,差誤成災(zāi)學(xué)說是由Orgel明確提出的，認為在DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和翻譯中發(fā)生誤差，這種誤差可以不斷擴大，造成細胞衰老、死亡。如DNA轉(zhuǎn)錄mRNA的過程發(fā)生微小的差異

61、，帶有該微小差異的mRNA會翻譯出進一步偏離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)如果屬于DNA聚合酶會合成差異程度更大的DNA，這樣的差錯經(jīng)過每一次信息傳遞都擴大一些，形成惡性循環(huán)，使細胞內(nèi)積累許多差錯分子造成災(zāi)難，細胞正常功能不能發(fā)揮，致使細胞衰老、死亡。,（1）端粒和端粒酶,細胞有限分裂學(xué)說“Hayflick”極限，即細胞最大分裂次數(shù)。L.Hayflick (1961)報道，人的成纖維細胞在體外培養(yǎng)時增殖次數(shù)是有限的（60~70代）。細胞增殖次

62、數(shù)與端粒DNA長度有關(guān)。,端粒學(xué)說由Olovnikov提出，認為細胞在每次分裂過程中都會由于DNA聚合酶功能障礙而不能完全復(fù)制它們的染色體，因此最后復(fù)制DNA序列可能會丟失，最終造成細胞衰老死亡。    端粒是真核生物染色體末端由許多簡單重復(fù)序列和相關(guān)蛋白組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，具有維持染色體結(jié)構(gòu)完整性和解決其末端復(fù)制難題的作用。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，是以自身RNA為模板，合成端粒重復(fù)序列，加到新合

63、成DNA鏈末端。在人體內(nèi)端粒酶出現(xiàn)在大多數(shù)的胚胎組織、生殖細胞、炎性細胞、更新組織的增生細胞以及腫瘤細胞中。正因如此，細胞每有絲分裂一次，就有一段端粒序列丟失，當(dāng)端粒長度縮短到一定程度，會使細胞停止分裂，導(dǎo)致衰老與死亡。,端粒是由簡單的富含T和G的DNA片段的重復(fù)序列組成。人類端粒結(jié)構(gòu)為染色體末端重復(fù)上千次的TTAGGG序列所組成。DNA聚合酶不能完成線性染色體末端DNA的復(fù)制， 由于RNA引物的原因，DNA聚合酶一定會留

64、下染色體末端的一段DNA（一段端粒）使其不被復(fù)制。那么真核細胞染色體末端的端粒就會隨著細胞分裂而縮短。這個縮短的端粒傳給子細胞后，隨著細胞的再次分裂進一步縮短。染色體末端端粒隨著每次細胞分裂逐漸縮短，直到不能分裂走向衰老。人類種系細胞一生中維持分裂。 不斷增殖的原因是該細胞表達端粒酶。端粒酶以自身一段RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄酶，轉(zhuǎn)錄出一段端粒片段并使之連接于染色體的端粒末端，使端粒不縮短，維持完整，從而保持了細胞的永生化生長。

65、,在單細胞生物、多細胞生物的種系細胞中都顯示出弱的端粒酶活性。而在人類正常組織的體細胞均無端粒酶活性。值得注意的是，在絕大多數(shù)惡性腫瘤細胞中顯示明顯的端粒酶活性，這可能是腫瘤細胞具有永生性生長的原因之一。,1990年，Harley等人通過人工合成的（TTAGGG）*3作為探針，對不同年齡的人的成纖維細胞的端粒長度測量，提出了“有絲分裂鐘學(xué)說”，即： 隨著細胞的每次分裂，端粒不斷縮短，當(dāng)端粒長度縮短到一定閾值時，細胞就進入衰老。

66、但是，不少研究報告不支持這一學(xué)說，如某些小鼠終生保持較長的端粒，也沒有因此而獲得延長壽命。,（2）基因?qū)W說,子女的壽命與雙親的壽命有關(guān)；各種動物都有相當(dāng)恒定的平均壽命和最高壽命；成人早衰癥：平均39歲時出現(xiàn)衰老，47歲生命結(jié)束；嬰幼兒早衰癥：1歲時出現(xiàn)明顯的衰老，12~18歲生命結(jié)束，早衰癥患者體內(nèi)解旋酶發(fā)生突變 。Caenrhabditis elegans的平均壽命僅3.5天，該蟲age-1 單基因突變，可提高平均壽命65

67、%，提高最大壽命110%。,SGA1基因、WRN基因與衰老,重復(fù)基因失活學(xué)說：如哺乳動物rRNA基因數(shù)隨年齡而減少。,SGS1基因?qū)湍傅囊吧秃蛃gs1突變株分裂次數(shù)的研究得出該基因的缺陷或喪失明顯影響了壽命。對突變株核仁的觀察研究得出轉(zhuǎn)錄的SGS1蛋白向核仁轉(zhuǎn)移，抑制其分裂，可延長壽命。,WRN基因 對Werner綜合癥的研究得出：WRN基因是維持正常壽命所必須的。,因此，這兩個基因是保證細胞正常生命周期所必需的 ，如果發(fā)

68、生突變，會引起衰老的提前發(fā)生或壽命的縮短。,衰老基因?qū)W說,衰老基因與抗衰老基因衰老基因人類：載脂蛋白Eε4基因、β淀粉樣蛋 白基因 p16, p53 p21 RB基因2. 抗衰老基因 WRN bcl-2,差錯學(xué)派,自由基或活性氧集團或分子（Reactive oxygen species,ROS),氧化性損傷學(xué)說,—— haman衰老自由基理論,指那些在原子核外層軌道上具有不