PI3K-AKT-GSK3β信號(hào)通路在雷公藤內(nèi)酯醇聯(lián)合紫杉醇促進(jìn)耐順鉑人上皮性卵巢癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　通過研究雷公藤內(nèi)酯醇(TP)聯(lián)合紫杉醇對(duì)耐順鉑人上皮性卵巢癌細(xì)胞（COC1/DDP細(xì)胞）凋亡的影響，以探討兩藥聯(lián)合對(duì)COC1/DDP細(xì)胞作用的機(jī)制，為TP聯(lián)合紫杉醇應(yīng)用于臨床治療耐藥性卵巢癌及擴(kuò)大TP應(yīng)用譜提供可行性依據(jù)。
　　方法:
　　1、將COC1/DDP細(xì)胞用含0.5ug/mlDDP，10％胎牛血清，90％RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，選用呈對(duì)數(shù)生

2、長細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組:空白對(duì)照組（加入完全培養(yǎng)基）、3.13ug/ml紫杉醇組、10umol/ml PI3K特異性抑制劑LY294002組、10ng/ml雷公藤內(nèi)酯醇(TP)組、10umol/ml LY294002+3.13ug/ml紫杉醇組及10ng/mlTP+3.13ug/ml紫杉醇組。
　　2、MTT法檢測各實(shí)驗(yàn)組分別作用于COC1/DDP細(xì)胞24h、48h、72h之后，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用，計(jì)算各組抑制率。<

3、br>　　3、普通光鏡及AO/EB染色熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組藥物作用24小時(shí)以后細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　4、Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測各實(shí)驗(yàn)組藥物作用24小時(shí)以后細(xì)胞凋亡率。
　　5、Western blot檢測空白對(duì)照組及各組藥物作用COC1/DDP細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β的表達(dá)的差異。
　　結(jié)果:
　　1、不同組藥物作用COC1/DDP細(xì)胞后

4、對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　各組細(xì)胞給予不同藥物分別作用24、48、72h后，MTT檢測各組細(xì)胞的增殖抑制率，從紫杉醇組→LY294002組→TP組→LY294002+紫杉醇組→TP+紫杉醇組，藥物作用24小時(shí)后細(xì)胞增殖抑制率分別為:39.33±3.567％、6.52±1.229％、45.61±2.645％、49.45±2.75％、56.09±3.131％;藥物作用48小時(shí)后細(xì)胞增殖抑制率分別為:50.74±2.763％、18.52±1

5、.145％、57.05±2.491％、66.33±3.471％、72.85±1.803％;藥物作用72小時(shí)后細(xì)胞增殖抑制率分別為:63.34±7.712％、32.787±2.726％、71.08±3.484％、86.33±3.583％、89.60±2.284％。結(jié)果表明TP+紫杉醇組抑制率高于TP、紫杉醇單用(P＜0.05)。LY294002+紫杉醇組抑制率高于LY294002、紫杉醇單用(P＜0.05)。在聯(lián)合用藥組中TP+紫杉醇組抑

6、制率高于LY294002+紫杉醇組(P＜0.05)。在單用藥組中TP組＞紫杉醇組＞ LY294002組(P＜0.05)。各組抑制率隨藥物作用時(shí)間延長而增高。
　　2、不同組藥物作用COC1/DDP細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)的變化
　　(1)普通光學(xué)顯微鏡下觀察COC1/DDP細(xì)胞形態(tài)的變化
　　空白對(duì)照組COC1/DDP細(xì)胞增殖良好，在普通光學(xué)顯微鏡下可見呈橢圓形，細(xì)胞核為卵圓形，染色質(zhì)豐富，折光性好。按不同分組藥物作用細(xì)胞24小

7、時(shí)后，在普通光學(xué)顯微鏡下可見各組細(xì)胞數(shù)目出現(xiàn)不同程度的減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生凋亡樣改變:如細(xì)胞質(zhì)空泡形成，細(xì)胞核固縮、碎裂等。各組細(xì)胞形態(tài)改變結(jié)果表明聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于各單用藥組，其中TP聯(lián)合紫杉醇組高于LY294002聯(lián)合紫杉醇組，而各單用藥組中TP作用凋亡數(shù)最多，LY294002作用凋亡數(shù)相對(duì)最少。
　　(2) AO/EB染色后熒光顯微鏡觀察COC1/DDP細(xì)胞形態(tài)的變化
　　空白對(duì)照組COC1/DDP細(xì)胞經(jīng)AO

8、/EB染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，呈綠色熒光。按不同分組藥物作用細(xì)胞24小時(shí)后，經(jīng)AO/EB染色在熒光顯微鏡下可見，紫杉醇組細(xì)胞核染色質(zhì)呈綠色熒光，但形態(tài)為固縮狀或圓珠狀，呈早期凋亡改變;LY294002組細(xì)胞呈綠色熒光，出現(xiàn)早期凋亡改變，但數(shù)目少于紫杉醇組;雷公藤內(nèi)酯醇組（TP組）細(xì)胞大多細(xì)胞染色質(zhì)呈固縮狀或圓珠狀，著橘紅色熒光，呈晚期凋亡改變，少數(shù)細(xì)胞呈早期凋亡改變，可見正常細(xì)胞;LY294002聯(lián)合紫杉醇組，大多數(shù)細(xì)

9、胞呈早期凋亡改變，少數(shù)呈晚期凋亡，仍少數(shù)可見正常細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)大于TP單用組;TP聯(lián)合紫杉醇組，細(xì)胞基本呈早期及晚期凋亡改變，基本未見正常細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)大于LY294002聯(lián)合紫杉醇組。各組細(xì)胞形態(tài)改變結(jié)果與普通光鏡觀察結(jié)果相符。
　　3、各組藥物作用于COC1/DDP細(xì)胞后檢測細(xì)胞凋亡率
　　COC1/DDP細(xì)胞經(jīng)各組藥物作用24小時(shí)后，分別進(jìn)行AnnexinV-FITC/PI凋亡染色，流式細(xì)胞儀檢測顯示凋亡率分別為:

10、紫杉醇組（14.90±1.253）％、LY294002組（11.20±1.682）％、TP組（39.0±3.816）％、LY294002+紫杉醇組（27.67±1.834）％、TP+紫杉醇組（51.13±3.325）％、空白組（5.87±1.815）％。結(jié)果表明:兩聯(lián)合用藥組凋亡率高于各自單藥組，TP+紫杉醇組凋亡率高于LY294002+紫杉醇組，各單藥組中凋亡率從高到底依次為:TP組、紫杉醇組、LY294002組。在空白對(duì)照組中可見少

11、量凋亡，多次重復(fù)試驗(yàn)仍可見，表明COC1/DDP細(xì)胞在沒有任何藥物作用的情況下，經(jīng)過24小時(shí)生長后，少數(shù)細(xì)胞自然發(fā)生凋亡，各組結(jié)果與空白組比較P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合用藥組與相應(yīng)單藥組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、藥物作用COC1/DDP細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞中AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β表達(dá)的變化
　　結(jié)果顯示藥物作用24小時(shí)后，各實(shí)驗(yàn)組總AKT蛋白的表達(dá)一致，并未發(fā)生任何改變，P-AKT蛋白的表達(dá)從

12、空白對(duì)照組到→紫杉醇組→LY294002組→TP組→LY294002+紫杉醇組→TP聯(lián)合紫杉醇組呈現(xiàn)出減少趨勢(shì)，各實(shí)驗(yàn)組總GSK3β蛋白的表達(dá)一致，P-GSK3β蛋白的表達(dá)從空白對(duì)照組→TP聯(lián)合紫杉醇組呈現(xiàn)出減少趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　1、紫杉醇、PI3K抑制劑LY294002、TP、LY294002聯(lián)合紫杉醇及TP聯(lián)合紫杉醇對(duì)體外培養(yǎng)的COC1/DDP細(xì)胞均具有增殖抑制作用，呈時(shí)間依賴關(guān)系。聯(lián)合用藥組的增殖抑制作用大于其相

13、對(duì)應(yīng)的各單藥組。在各單藥組中，TP抑制作用最大，LY294002最小。聯(lián)合用藥組中，TP聯(lián)合紫杉醇的增殖抑制作用大于LY294002聯(lián)合紫杉醇。
　　2、PI3K抑制劑LY294002單獨(dú)使用促進(jìn)COC1/DDP細(xì)胞凋亡的凋亡率為（11.20±1.682）％，而TP單獨(dú)使用時(shí)該細(xì)胞的凋亡率為（39.0±3.816）％，TP較LY294002對(duì)COC1/DDP細(xì)胞的促凋亡效果更顯著。
　　3、LY294002、TP均能協(xié)同紫杉