產(chǎn)絮菌合成生物絮凝劑特性及絮凝成分解析.pdf

1、城鎮(zhèn)用水和工業(yè)廢水處理中，生物下游工業(yè)及食品生產(chǎn)和發(fā)酵工藝中，絮凝過程是應(yīng)用最普遍的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，同時(shí)絮凝過程的研究趨勢(shì)也由過去側(cè)重工藝的優(yōu)化逐漸發(fā)展為現(xiàn)在側(cè)重藥劑的開發(fā)。生物絮凝劑作為一種安全無(wú)毒、絮凝活性高、無(wú)二次污染的新型絮凝劑，對(duì)人類健康和環(huán)境保護(hù)都有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。但是，目前大部分研究多處于實(shí)驗(yàn)室階段，而且產(chǎn)量低且生產(chǎn)成本高，在很大程度上限制了生物絮凝劑的生產(chǎn)和應(yīng)用?；诖?，本課題通過對(duì)產(chǎn)絮凝菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、生物絮凝劑的分離

2、純化、組成結(jié)構(gòu)分析及合成代謝的研究，為生物絮凝劑的理論研究提供參考，也為生物絮凝劑的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)保證。
　　采用平板劃線法對(duì)產(chǎn)絮性能退化的絮凝菌 F2進(jìn)行復(fù)壯，復(fù)壯后的產(chǎn)絮菌F2所產(chǎn)生物絮凝劑的絮凝效果已恢復(fù)至原始菌的95％以上，且生長(zhǎng)旺盛，將其作為今后試驗(yàn)的出發(fā)菌株。采用三種方法對(duì)絮凝菌F2的生長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，0-15h為指數(shù)生長(zhǎng)期，15-24h為穩(wěn)定期，24h后為衰亡期，其代時(shí)為44.1min。對(duì)絮凝菌F2發(fā)酵過程的溶解氧、pH

3、值、菌體干重、生物絮凝劑活性成分含量、絮凝率、蛋白質(zhì)、葡萄糖、總氮及總磷進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，并對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明K2HPO4是發(fā)酵培養(yǎng)基中必不可少的，且用量不能少于5.0g/L，而KH2PO4則可以選擇性的添加或不添加。根據(jù)絮凝菌F2發(fā)酵過程中菌體的生長(zhǎng)、底物葡萄糖的消耗和絮凝活性物質(zhì)合成變化，確定屬于產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型發(fā)酵。并基于Logistic方程和Luedeking-Priet方程建立了描述絮凝菌F2發(fā)酵過程中菌體

4、生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成和底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型。經(jīng)計(jì)算，三種模型均較準(zhǔn)確的模擬了其過程。
　　絮凝菌F2產(chǎn)生的生物絮凝劑大部分存在于胞外的培養(yǎng)液中，它是由微生物分泌到胞外的，其絮凝作用不是由菌體細(xì)胞產(chǎn)生的。生物絮凝劑具有一定的熱穩(wěn)定性，但隨著pH值的變化絮凝活性波動(dòng)較劇烈。同時(shí)對(duì)生物絮凝劑的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。以上結(jié)果都表明，生物絮凝劑中含有多糖和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其中多糖含量明顯高于蛋白質(zhì)含量，多糖與蛋白質(zhì)含量比值為97.4:2.2，且多糖為

5、絮凝功能的主要承擔(dān)者。利用有機(jī)溶劑對(duì)生物絮凝劑活性成分進(jìn)行提取，確定了最佳提取條件為：濃縮倍數(shù)為1/2，乙醇濃度為100%，乙醇用量為1:2，沉淀時(shí)間為2h，沉淀pH值為6。經(jīng)初步提取的生物絮凝劑中含有大量游離蛋白質(zhì)，利用法對(duì)有機(jī)溶劑提取后的生物絮凝劑去除蛋白質(zhì)，確定了最佳去除游離蛋白質(zhì)條件為：V樣品：Vsevage為2:3，V氯仿：V正丁醇為5:2，時(shí)間為30min。生物絮凝劑經(jīng)初步分離提取后，蛋白質(zhì)的含量顯著降低。提取后得到的粗品溶

6、解后呈淡黃色且較粘稠，絮凝活性有明顯提高。
　　根據(jù)生物絮凝劑的性質(zhì)，選擇了三種弱陰離子交換凝膠DEAE Sephadex A-25、DEAE Sepharose Fast Flow和 DEAE-650M對(duì)生物絮凝劑粗品進(jìn)行純化預(yù)試驗(yàn)，從中選擇出一種最適合純化生物絮凝劑的離子交換凝膠DEAE-650M。對(duì)離子交換層析進(jìn)行洗脫速度、收集量和上樣量的選擇，最終確定了離子交換層析純化生物絮凝劑粗品的最佳條件為：DEAE-650M離子交換

7、凝膠，2.6?20cm柱子，pH8.0Tris-HCl起始緩沖液，0-1.5mol/LNaCl梯度洗脫，上樣量為6mL，洗脫速度為54mL/h，收集量為3mL/管。
　　絮凝菌F2產(chǎn)生的生物絮凝劑純化物為白色棉絮狀固體。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，只有一條藍(lán)色條帶。其紫外吸收光譜顯示，生物絮凝劑純品中具有蛋白質(zhì)和糖類特征基團(tuán)，且不含核酸類大分子。生物絮凝劑純品的 HPLC為單一峰，采用GPC法測(cè)定分子量，不同已知分子量的多糖作標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)計(jì)

8、算分子量為1156,000Da。多糖的薄層層析、GC和GC-MS分析，均表明其主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成。紅外光譜圖表明其既含有蛋白質(zhì)的特征基團(tuán)氨基(或酰氨基)，又含有糖的特征基團(tuán)羧基和羥基，單糖為吡喃糖。1HNMR說(shuō)明生物絮凝劑活性中心多糖的每個(gè)重復(fù)單位中含有3個(gè)糖基單元，分別為α-吡喃型半乳糖、吡喃型甘露糖和α-吡喃型葡萄糖，它們的質(zhì)量比約為1：3：5，它們以α和糖苷鍵相連，化學(xué)式為[C54H108O54]n。
　　根據(jù)