版權(quán)說明：本文檔由用戶提供并上傳，收益歸屬內(nèi)容提供方，若內(nèi)容存在侵權(quán)，請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、DIGDIG檢測試劑盒疑難問題及解決方案檢測試劑盒疑難問題及解決方案一、靈敏度低或信號弱的問題及解決方案？1.探針標(biāo)記效率低：2.膜的問題：使用陽性尼龍膜3.雜交：增加標(biāo)記探針的濃度，或減少洗滌時的嚴(yán)謹(jǐn)性4.曝光時間：增加曝光時間；使用高靈敏度的專用化學(xué)發(fā)光的LumiFilm膠片，其他像KodakXAR也可。二、高背景解決方案1.探針標(biāo)記：純化的DNA或RNA在標(biāo)記前用乙醇沉淀；確認(rèn)探針對靶序列是特異性并跟其他載體無同源性；2.膜：推薦
2、使用羅氏或經(jīng)過驗證的膜(pall)、Ambion膜3.雜交：使用CDPStar發(fā)光底物，最好將DIG探針濃度稀釋到（RNA2050ngml）另外在雜交過程中不要讓膜干燥4.檢測過程：將抗DIGAP的酶的濃度到由原來的1:20000減少到1:50000，也不會減少酶檢測的靈敏度。增加洗脫和封閉的溶液的量和次數(shù)；膜上出現(xiàn)斑點可能是由于酶在膜上的凝集，需要將膜短暫離心后使用。5.曝光時間：縮短曝光時間，通常為1560s。DNA酶消化后去除模板
3、DNA。3PCR法：包括線性擴(kuò)增和不對稱PCR。線性擴(kuò)增PCR只使用單一引物，一定要去除未結(jié)合的核苷酸。不對稱PCR可使用上下游引物。但下游引物濃度更高有利于合成反義核苷酸。可使用PCR或反轉(zhuǎn)錄PCR為模板。4.引物延伸法：二、雜交溫度的優(yōu)化1.RAN探針：在高溫68℃，高AT含量或與靶基因出現(xiàn)多個誤配的探針，可能雜交失敗。如果在此溫度信號較弱，盡量減少雜交和洗脫溫度至60℃.2.DNA探針：如果在42度有交叉反應(yīng)(非特異性帶)，則增加
4、溫度到4548℃.3.寡核苷酸探針有較低的Tm值，如果在37℃雜交信號弱或無信號則用等量的2.5SSC7%SDS稀釋雜交液再回復(fù)到3742℃雜交和洗脫。(二)條帶高背景的原因1.低于最適的雜交溫度：如DNA探針溫度為42℃，RNA探針為65℃，如低于此溫度會出現(xiàn)高背景或交叉反應(yīng)。雜交溫度需憑經(jīng)驗來確定2.探針濃度太高:如RNA探針濃度為0.1nMDNA化學(xué)標(biāo)記法濃度為1pM，內(nèi)部參入法為10pM，放射性標(biāo)記為106cpmmL.使用更高濃
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明，都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等，如果需要附件，請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙，網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽，若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間，僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理，對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯，并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容，請與我們聯(lián)系，我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
評論
0/150
提交評論