土壤微生物量碳測(cè)定方法

1、1土壤微生物量碳測(cè)定方法及應(yīng)用土壤微生物量碳測(cè)定方法及應(yīng)用土壤微生物量碳（Soilmicrobialbiomass）不僅對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的循環(huán)起著主要作用，同時(shí)是一個(gè)重要活性養(yǎng)分庫(kù)，直接調(diào)控著土壤養(yǎng)分（如氮、磷和硫等）的保持和釋放及其植物有效性。近40年來(lái)，土壤微生物生物量的研究已成為土壤學(xué)研究熱點(diǎn)之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(MicrobialbiomasscarbonBc)來(lái)表示土壤微生物生物量的

2、大小。測(cè)定土壤微生物碳的主要方法為熏蒸培養(yǎng)法（FumigationincubationFI）和熏蒸提取法（FumigationextractionFE）。熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培養(yǎng)法測(cè)定土壤微生物量碳不僅需要較長(zhǎng)的時(shí)間而且不適合于強(qiáng)酸性土壤、加入新鮮有機(jī)底物的土壤以及水田土壤。Voney(1983)發(fā)現(xiàn)熏蒸土壤用0.5molL1K2SO4提取液提取的碳量與生物微生物量有很好的相關(guān)性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法測(cè)定土壤

3、微生物碳的基本方法：該方法用0.5molL1K2SO4提取劑（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有機(jī)碳含量用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定；以熏蒸與不熏蒸土壤提取的有機(jī)碳增加量除以轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC(取值0.38)來(lái)計(jì)算土壤微生物碳。Wu等（1990）通過(guò)采用熏蒸培養(yǎng)法和熏蒸提取法比較研究，建立了熏蒸提取——碳自動(dòng)一起法測(cè)定土壤微生物碳。該方法大幅度提高提取液中有機(jī)碳的測(cè)定速度和測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。林啟美等（1999）對(duì)熏蒸提取重鉻酸鉀氧化

4、法中提取液的水土比以及氧化劑進(jìn)行了改進(jìn)，以提高該方法的測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。對(duì)于熏蒸提取法測(cè)定土壤微生物生物碳的轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC的取值，有很多研究進(jìn)行了大量的研究。測(cè)定KEC值的實(shí)驗(yàn)方法有：直接法（加入培養(yǎng)微生物、用14C底物標(biāo)記土壤微生物）和間接法（與熏蒸培養(yǎng)法、顯微鏡觀測(cè)法、ATP法及底物誘導(dǎo)呼吸法比較）。提取液中有機(jī)碳的測(cè)定方法不同（如氧化法和儀器法），那么轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC取值也不同，如采用氧化法和一起法KEC值分別為0.38（V

5、ance等，1987）和0.45（Wu等，1990）。不同類(lèi)型土壤（表層）的KEC值有較大不同，其值變化為0.200.50（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dict等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同濃度土層土壤的轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC有較大的差異，從表層020cm土壤的KEC為0.41，逐步降低到180220cm土壤的KEC為0.31。一、基本原理熏蒸提取法測(cè)定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤時(shí)由于微

6、生物的細(xì)胞膜被氯仿破壞而殺死，微生物中部分組分成分特別是細(xì)胞質(zhì)在酶的作用下自溶和轉(zhuǎn)化為K2SO4溶液可提取成分（Joergensen1996）。采用重鉻酸鉀氧化法或碳自動(dòng)分析儀器法測(cè)定提取液中的碳含量，以熏蒸與不熏蒸土壤中提取碳增量除以轉(zhuǎn)換系數(shù)KEC來(lái)估計(jì)土壤微生物碳。二、試劑配制（1）硫酸鉀提取劑（0.5molL1）：取871.25g分析純硫酸鉀溶解于蒸餾水中，定溶至10L。由于硫酸鉀較難溶解，配制時(shí)可用20L塑料桶密閉后置于苗床上（

7、60100revmin1）12小時(shí)即可完全溶解。（2）0.2molL1（16K2Cr2O7）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取130℃烘23小時(shí)的K2Cr2O7（分析純）9.806g于1L大燒杯中，加去離子水使其溶解，定溶至1L。K2Cr2O7較難溶解，可加熱加快其溶解。（3）0.1000molL1（16K2Cr2O7）標(biāo)準(zhǔn)溶液：取經(jīng)130℃烘23小時(shí)的分析純重鉻酸鉀4.903g，用蒸餾水溶解并定溶至1L。3熏蒸過(guò)程需要24小時(shí)，因此通常在熏蒸時(shí)，將不熏蒸

8、土壤可置于4℃條件下保存。（3）土壤提取將除去氯仿后的熏蒸土壤轉(zhuǎn)移到125ml提取瓶中，與不熏蒸土壤同時(shí)采用50ml可調(diào)加液器加入100ml0.5molL1K2SO4提取液，水土比為1：4，并設(shè)3個(gè)試劑空白。如果采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定提取液中有機(jī)碳，也可采用2：；1的水土比，即加入50ml0.5molL1K2SO4提取液。在往復(fù)式振蕩器中振蕩（300revmin1）提取30分鐘，再用定量中速濾紙過(guò)濾于50ml塑料瓶中，貯藏于18℃冷凍柜

9、中，待測(cè)。經(jīng)貯藏的土壤提取液解凍后會(huì)有一些白色沉淀，據(jù)推測(cè)為CaSO4和4K2SO4，對(duì)提取液中有機(jī)碳的測(cè)定沒(méi)有影響，可以不必除去這些白色沉淀（Brookes等，1985）。（4）提取液中有機(jī)碳含量測(cè)定和土壤微生物碳計(jì)算：方法Ⅰ：重鉻酸鉀氧化法（林啟美等1999；Vance等1987）吸取10ml上述土壤提取液于經(jīng)過(guò)仔細(xì)檢查的150ml消化管（24295mm）中，加入5.0ml0.2molL1K2Cr2O7，5.0ml濃H2SO4溶液，

10、再加入少量經(jīng)濃硫酸處理的碎瓷片（3mm大小，防爆），混勻，置于1751℃磷酸浴中煮沸10分鐘，應(yīng)注意消煮的時(shí)間應(yīng)保證準(zhǔn)確一致。冷卻后將溶液轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，使總體積約為80ml，加入1滴鄰啡羅啉指示劑，用0.05molL1硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定消煮液中剩余的重鉻酸鉀，滴定過(guò)程為先由橙黃色變?yōu)樗{(lán)綠色，再變?yōu)樽丶t色，即到達(dá)終點(diǎn)。結(jié)果計(jì)算：提取的土壤有機(jī)碳（mgCkg1土）=[0.0124106M(V0V)f]W式中：M——為FeSO4

11、溶液濃度（molL1）；V0、V——分別為滴定空白和樣品消耗的FeSO4溶液體積（ml）；f——為稀釋倍數(shù)；W——為烘干土重（g）；0.012——為碳毫摩爾質(zhì)量（g）；106——為換算系數(shù)。土壤微生物碳：Bc=EcKc式中：Bc代表土壤微生物碳（mgCkg1）；Ec=熏蒸土壤提取的有機(jī)碳不熏蒸土壤提取的有機(jī)碳，單位mgCkg1；Kc為轉(zhuǎn)換系數(shù)，采用重鉻酸鉀氧化法取值0.38（Vance等，1987）。方法Ⅱ：碳自動(dòng)分析儀器法（Wu等，1

12、990）取10ml土壤提取液于40ml樣品瓶中。加入10ml，5%六偏磷酸鈉溶液（pH2.0），使提取液中的沉淀（CaSO4和4K2SO4）全部溶解。再用直徑為2mm的細(xì)管向樣液中通過(guò)高純度氮?dú)猓?10分鐘），以除去溶解在樣液中的CO2，然后用Phoenix8000碳自動(dòng)分析儀測(cè)定，待測(cè)提取液中的有機(jī)碳在硫酸鉀溶液作用下于紫外氧化室中氧化為CO2，該儀器可自動(dòng)測(cè)定有機(jī)碳氧化放出的CO2量，通過(guò)工作曲線即可計(jì)算出提取液中的碳含量。工作曲線

13、制備：分別吸取0、0.5、1、2、3、4ml濃度為1000mgCL1鄰苯二甲酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液溶于50ml容量瓶中，用高純度去離子水定容，即為0、10、20、40、60、80mgCL1系列標(biāo)準(zhǔn)碳溶液。分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml于樣品瓶中，加入10ml，5%的六偏磷酸鈉溶液（pH2.0），測(cè)定方法同土壤提取液樣品。結(jié)果計(jì)算：提取液有機(jī)碳含量（mgCkg1）=測(cè)定液的碳含量（mgCL1）稀釋倍數(shù)烘干土重（g）；土壤微生物碳：Bc=EcKc式