細菌的染色

1、實驗一實驗一細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法一、目的要求一、目的要求1.學習微生物涂片、染色的基本技術(shù)，并掌握革蘭氏染色的方法。2.初步認識細菌的形態(tài)特征，掌握無菌操作技術(shù)。3.了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。二、基本原理二、基本原理1.簡單染色法：簡單染色法：用單一染料進行細菌染色，操作簡便，適于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用堿性染料堿性染料進行簡單染色，這是因為：在中性、堿性或弱堿

2、性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料電離時，其分子的染色部分帶正電荷），因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結(jié)合使細菌著色，經(jīng)染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下易于識別。常用作簡單染色的染料有：美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅等。2.革蘭氏染色法革蘭氏染色法革蘭氏染色反應(yīng)是細菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)生Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法（Gramstain）不僅能觀

3、察到細菌的形態(tài)特征而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G表示；染色反應(yīng)呈紅色（復染顏色）的稱為革蘭氏染色陰性細菌，用G表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫－碘復合物被保留在細胞內(nèi)而不易著色，因此，呈現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性細菌

4、的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫－碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料（basicdye）初染液；媒染劑（mdant）；脫色劑（decolisingagent）和復染液(counterstain)。堿性染料的作用象在細菌的簡單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫(

5、crystalviolet)。媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和力或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使不易脫落，不同類型的細胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精(ethanol)。復染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，從而將細胞區(qū)分成G和G兩大類群，常用的復染液是番紅。三、器材三、器材實驗二實驗二細菌的芽

6、孢和莢膜染色法細菌的芽孢和莢膜染色法一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?.學習并掌握芽孢和莢膜染色法2.初步了解芽孢和莢膜的形態(tài)。二、基本原理二、基本原理芽孢又叫內(nèi)生孢子(endosopre)，是某些細菌生長到一定階段在菌體內(nèi)形成的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細菌能否形成芽孢以及芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊內(nèi)的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒定細菌的依據(jù)之一。芽孢染色法是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同染料進行著色，使芽孢和菌體呈不

7、同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當先用弱堿性染料，如孔雀綠（malachitegreen）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可進入菌體，而且也可進入芽孢，進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再用復染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。莢膜是包圍在細菌細胞外面的一層粘液性物質(zhì)，其主要成分是多糖類，不易染色，故常用襯托

8、染色法，即將菌體和背景著色，而把不著色且透明的莢膜襯托出來。莢膜很薄，易變形，因此，制片時一般不用熱固定。三、器材三、器材枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），臘樣芽孢桿菌（B.cereus），球形芽孢桿菌(B.sphaericus)，生孢梭菌（Clostridiumspogenes）；圓褐固氮菌（Azotobacterchroococcum）或膠質(zhì)芽孢桿菌(B.mucilaginosus)約2d無氮培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物；孔

9、雀綠染液，番紅水溶液，苯酚品紅溶液，黑色素溶液。莢膜染色液：繪圖墨水，1％甲基紫水溶液，1％結(jié)晶紫水溶液，6％葡萄糖水溶液，20％硫酸銅水溶液，純甲醇等。四、操作步驟四、操作步驟（一）莢膜染色技術(shù)（一）莢膜染色技術(shù)方法一：方法一：（1）將培養(yǎng)24h左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加3～5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染