廢水處理系統(tǒng)中重要功能類群Thauera屬種群結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、在廢水生物處理系統(tǒng)中,污染物的去除主要是由其中的微生物群落完成的,微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能往往決定了整個(gè)裝置的性能。Thauera屬細(xì)菌就是一類廣泛存在于各種類型的廢水處理裝置中并具有多種芳香族污染物降解能力的重要功能類群,深入研究其種群組成與降解功能,具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 由于分離比較困難、缺少專一性的分子檢測(cè)方法,人們對(duì)于廢水處理系統(tǒng)中Thauera屬種群的結(jié)構(gòu)與功能的了解還非常有限。
　　 為此,本論

2、文建立了Thauera特異性、嵌套式PCR-DGGE(denaturinggradient gel electrophorcsis)的方法用于環(huán)境樣品中Thauera種群結(jié)構(gòu)的研究。對(duì)一個(gè)來自廢水處理系統(tǒng)的生物膜樣品以Thauera特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物建立了克隆文庫(kù),所有測(cè)序的克隆(91個(gè))都屬于Thauera屬,說明該P(yáng)CR方法具有很高特異性。為了快速簡(jiǎn)便的比較不同樣品中Thauera的結(jié)構(gòu),以特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行16S r

3、RNA基因V3區(qū)嵌套式擴(kuò)增后用于DGGE分析,建立了Thauera特異性PCR-DGGE方法。13個(gè)帶有不同V3序列的克隆在DGGE上形成了10條條帶,說明該方法具有較高的分辨率,可以用于檢測(cè)樣品中的Thauera屬的組成。
　　 在一個(gè)大型焦化廢水處理裝置由于回流泵機(jī)械故障而導(dǎo)致化學(xué)需氧量(COD)去除率逐漸降低時(shí),我們使用建立的特異性PCR-DGGE方法對(duì)系統(tǒng)中Thauera的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了追蹤監(jiān)測(cè)。對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行主

4、成份分析(PCA)后,發(fā)現(xiàn)當(dāng)系統(tǒng)COD的去除率從前4周的84.1±2.7％降到第5和第6周的低于75％時(shí),Thauera種群結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出相應(yīng)的時(shí)間演替軌跡,表明Thauera種群結(jié)構(gòu)的變化與系統(tǒng)COD去除功能的波動(dòng)密切相關(guān)。
　　 為了分離焦化廢水處理系統(tǒng)中常規(guī)方法難以分離的Thauera細(xì)菌,我們?cè)O(shè)計(jì)了一套以Thauera特異性16S rRNA基因?yàn)榘邢虻姆蛛x方法。根據(jù)已知Thauera的代謝特性及目標(biāo)菌的生活環(huán)境,設(shè)計(jì)了6種培

5、養(yǎng)基,并使用Thauera特異性PCR-DGGE方法對(duì)焦化廢水處理裝置反硝化池樣品在不同培養(yǎng)條件下獲得的Thauera多樣性進(jìn)行了分析。選取多樣性較高的培養(yǎng)基1/10 NB與MMQ在好氧條件下進(jìn)行分離培養(yǎng)。以Thauera特異性PCR方法篩選陽(yáng)性菌落,并用DGGE方法檢驗(yàn)菌落的純度。將含有Thauera的混合菌落在不同的選擇性培養(yǎng)基上多次劃線,使用特異性PCR及DGGE方法追蹤含有Thauera的菌落并分析其純度,最終從反硝化池樣品中純

6、化獲得了3株Thauera菌株(Q4、3-35和Q20-C)。這種以特異性分子標(biāo)記為靶向分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法,提高了細(xì)菌篩選的靈敏度,可協(xié)助分離常規(guī)方法難以分離的細(xì)菌。
　　 隨后,對(duì)這3株Thauera菌株的基因及其污染物降解能力進(jìn)行了比較分析。測(cè)序結(jié)果表明這3株Thauera細(xì)菌具有相同的16S rRNA基因,但是它們的ERIC-PCR基因組指紋圖譜卻存在顯著差異(相似性<65％)。使用氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)這

7、3株菌的污染物降解能力進(jìn)行了測(cè)定。好氧條件下,它們能降解焦化廢水中除喹啉外的所有主要有機(jī)污染物(苯酚、甲酚、二甲酚及吲哚等),但苯酚降解速度卻各不相同(Q4>3-35>Q20-C)。在已知的8個(gè)Thauera種中,只有T.phenylacetia能在好氧條件下降解其中的一種污染物(苯酚)。雖然Q20-C含有亞硝酸鹽還原酶基因(nirS),但這3株菌都沒有顯現(xiàn)出反硝化能力,而已知的Thauera細(xì)菌則都是反硝化菌。以上結(jié)果表明,這3個(gè)從焦

8、化廢水處理裝置中分離到的細(xì)菌可能代表了一種新的Thauera類型,具有廣泛的芳香族污染物降解能力。
　　 為了了解Thauera屬細(xì)菌在廢水處理脫氮過程中的作用,我們研究了8個(gè)不同來源的Thauera菌株(T.aminoaromatica、T.linaloolentis、T.phenylacetica、T.terpenica、Thauera sp.DNT-1、Thauera sp.27、Thauera
　　 sp.28及

9、Thauera sp.63)的反硝化功能及基因。反硝化過程中,所有Thauera均只產(chǎn)生少量的NO(<50 nmol/flask；<32.9 nM in liquid)。除T.phenylacefica外,其余Thauera菌株都可將硝態(tài)氮徹底轉(zhuǎn)化為氮?dú)狻CR分析后發(fā)現(xiàn)T.phenylacetica缺失了N2O還原酶(nos)基因,使它的反硝化終產(chǎn)物為N2O。對(duì)T.aminoaromatica在不同pH、O2及NOx條件下的反硝化過程

10、進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),在pH7-9范圍內(nèi),隨著pH的升高,積累的中間產(chǎn)物(NO和N2O)會(huì)減少。相比于NO-3,以NO-2作為電子受體,不僅使得積累的N2O量顯著升高(6-40倍),還使其開始反硝化的O2濃度從<0.8μM提高到了>4μM。這說明NO-2能誘導(dǎo)T.aminoaromatica反硝化基因的表達(dá)。在反硝化進(jìn)行時(shí),只有N2O還原酶的活性會(huì)被O2立刻抑制,而其他反硝化酶的活性基本不受的影響。這進(jìn)一步闡明了氧氣調(diào)控反硝化過程的機(jī)制。