聚乳酸生物降解酶及其催化特性研究.pdf

1、石油基塑料作為材料產業(yè)的一大支柱，已經成為社會生活不可或缺的一部分，但隨著白色污染的嚴重及石油資源的日益匱乏，其地位明顯動搖，綠色高分子材料逐步受到青睞。目前開發(fā)的綠色高分子材料主要是聚酯類，其優(yōu)勢體現在具有生物可降解性和可再生性；而且，天然的或經過改性的聚酯具有和傳統(tǒng)塑料相當甚至更優(yōu)的機械性能和物理化學性能，能夠滿足人們社會生活的需求，其中聚乳酸(PLA)以其優(yōu)良的物理化學性能和潛在的成本優(yōu)勢尤受人們的關注。目前相對于其它高分子材料，

2、PLA已經以其性能和成本優(yōu)勢率先實現了大規(guī)模的產業(yè)化生產，成功地應用于醫(yī)療、紡織和包裝等產業(yè)，被認為是最具潛力的替代現有塑料的新型“生態(tài)材料”之一。 雖然PLA在性能和生產應用上與其它聚酯相比具有明顯的優(yōu)勢，但其生物降解的研究卻相對滯后。PLA在自然界中降解緩慢，發(fā)現的降解微生物和高效降解酶有一定的特殊性，這限制了針對PLA廢棄物處理回收系統(tǒng)的開發(fā)，而沒有成功的回收系統(tǒng)將無法實現PLA生產的物料循環(huán)。目前PLA的降解機理尚未闡

3、明，這在很大程度上限制了可控降解材料的開發(fā)，也限制了PLA材料的推廣和應用，只有強化PLA的快速降解性和完全降解性機理的研究，才能夠真正實現其環(huán)境友好化。因此，本文從PLA降解菌株出發(fā)，研究了PLA降解酶的性質及催化特性，從酶催化機理及進化分析的角度對PLA的降解機制進行了探討。 本文主要的工作內容及結果如下： 1.通過對土壤樣品和菌種庫菌種的篩選，獲得了一株高效降解PLA的菌株——Amycolatopsis ori

4、entalis。 自然界中降解PLA的菌株十分有限，主要集中在稀有放線菌中。本文通過土壤和菌種庫的篩選獲得了對PLA具有降解作用的菌株，并以其中降解能力相對高效的.Amycolatopsis orientalis為研究對象，進行了降解性能的評價和表征，證實該菌株可以以PLA為唯一碳源進行生長，吸收降解產物乳酸。誘導實驗結果顯示該菌株分泌產生誘導型的PLA降解酶，除了PLA以外，蛋白類物質(明膠、蠶絲、蛋白胨等)也可以高效的誘導

5、PLA降解酶的產生，推測降解酶與蛋白酶類存在著一定的相關性。通過比較，確定選擇明膠為最佳誘導物進行下一步的誘導產酶。 2.從Amycolatopsis orientalis發(fā)酵液中同時分離到了三種對PLA具有高效降解作用的降解酶。 目前國際上報道的從聚乳酸降解菌株中分離得到的降解酶只有3個，并且均為單酶組分。本文首次利用離子交換、疏水層析、分子篩層析等分離方法從Amycolatopsis orientalis發(fā)酵液中分離到了三

6、種對PLA具有高效降解作用的降解酶，并對其催化特性進行了系統(tǒng)的研究。研究發(fā)現三種降解酶的分子量分別為24.0、19.5和18.0 kDa，且均為堿性蛋白?；钚员容^及動力學參數分析都顯示出這些降解酶對PLA的降解活性均比PLA的代表性降解酶-蛋白酶K要高。除了對PLA具有降解作用以外，這些PLA降解酶對蛋白及小肽類物質也都具有降解活性，且受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的強烈抑制，從催化特性上分析該酶可能屬于絲氨酸蛋白酶。MALDI-TOF肽

7、指紋圖譜分析結果顯示，三個降解酶的胰酶酶解峰各不相同，可能不是來源于同一前體，而是獨立的降解酶組分；質譜結果的數據庫比對沒有找到匹配程度較高的蛋白，暗示這些降解酶可能是沒有經過系統(tǒng)研究的新的酶類。 3.利用降解酶生化信息克隆到兩個PLA降解酶基因，并初步實現了其異源表達。 目前僅有兩篇文章報道了PLA降解酶基因的相關信息，一篇是通過基因組文庫進行功能篩選獲得其基因，另一篇是通過對降解酶進行有限酶解后測序設計相應探針從

8、基因組文庫中獲取相關基因。本文根據降解酶具有絲氨酸蛋白酶的生化性質，推測其具有保守的絲氨酸位點，根據保守位點序列及酶的N端測序結果設計引物，PCR擴增部分基因序列，然后通過一種新興的染色體步移技術--SEAF-PCR克隆全長基因，獲得了兩個降解酶PLAaseⅡ和PLAaseⅢ的基因序列；同時，將PLA降解酶基因分別在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌中進行了表達，獲得了具有活性的重組表達蛋白，初步建立了PLA降解酶的表達體系，從而為深入精細地研究其

9、功能機制奠定了基礎。 4.序列比對及同源模建揭示了PLA降解酶結構的特殊性。 通過網上數據庫及一系列生物信息學軟件對降解酶的結構進行了分析。結果顯示，PLAase2和PLAase3屬于絲氨酸蛋白酶家族的SlA亞族，具有絲氨酸蛋白酶的保守結構域，三聯體活性中心并未發(fā)生明顯變化，分別對應于PLAase2的H71、D103、S190和PLAase3的H32、D58、S135；而且其整體結構也和蛋白酶家族中的其它酶一樣具有兩

10、個β桶結構域，活性中心處于兩個桶之間的裂縫中；對胰凝乳蛋白酶極性環(huán)境的穩(wěn)定性和氧負離子洞形成十分重要的S214殘基和G193殘基也都存在，分別對應于PLAase2中的S215、G188和PLAase3中的S150、G133。但PLAase2和PLAase3的底物結合口袋具有明顯的特異性，關鍵的216位和226位氨基酸與家族中其它成員的不同；被認為在P1口袋處形成二硫鍵為洞穴提供剛性的C191和C220，及包含了Ca結合位點E70和E80

11、殘基，在PLAase2和PLAase3中都不存在。這些結果暗示可能正是-由于這些差異性導致了PLAase2和PLAase3結構與其它絲氨酸蛋白酶的不同，其P1結合口袋可能具有更大的柔性從而造成了特殊的底物特異性，使降解酶更容易與PLA結合。同時本文利用Insightll模建軟件，對PLAase2和PLAase3及目前NCBI中收錄的PLA降解酶序列進行了同源模建，結果顯示這些PLA降解酶在骨架結構上與模板酶沒有明顯的差別，發(fā)生變化的部分

12、主要在于S1底物結合口袋及表面的loop區(qū)，而這些位置已經被證明與酶的底物特異性密切相關，因此推測這些區(qū)域可能是使PLA降解酶具有特殊活性的關鍵結構。另外，系統(tǒng)發(fā)育樹分析還顯示出，這些降解酶只與高GC含量的革蘭氏陽性菌的絲氨酸蛋白酶同源性較高(50％左右)，除保守位點外，其它區(qū)域序列與家族中其它成員相比相似性很低，推測PLA降解酶處于獨特的進化地位，具有“古老”的蛋白酶骨架，而催化活性相關部位具有較高的可塑性。對PLA降解酶系統(tǒng)的深入研

13、究對于揭示這一類特殊酶的功能和進化地位具有重大意義。 5.對降解酶降解PLA的機制進行了探討。 基于上述分析結果，對PLA的降解機制進行了探討，提出了PLA與天然蛋白質結構上的類似性為PLA的降解提供了充分條件；特殊酶的存在是PLA降解的必要條件。推測這類降解酶對PLA具有降解作用不只因為其具有蛋白酶保守的活性位點，更關鍵的在于其底物結合口袋及表而loop區(qū)的特殊性，使酶具有了更為廣泛的底物特異性，從而能夠對PLA進