第六章 蛋白質(zhì)的分離、純化

1、第六章 蛋白質(zhì)的分離、純化和表征,一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì),蛋白質(zhì)中的功能團(tuán)　 末端α－NH2　　 末端α－COOH　　 側(cè)鏈基團(tuán)所以，蛋白質(zhì)的化學(xué)物理性質(zhì)＝AA,,A．蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，能和酸或堿發(fā)生作用?！．蛋白質(zhì)分子的可解離基團(tuán)來(lái)自側(cè)鏈上的功能團(tuán)?！．結(jié)合蛋白質(zhì) 輔基成分包含可解離蛋白質(zhì)　D．末端α-COOH, α-NH2　E．蛋白質(zhì)分子中可解離基團(tuán)的pK'和游離AA中相應(yīng)

2、基團(tuán)的pK'值完全不相同?！　　咴诘鞍踪|(zhì)分子中受到鄰近電荷的影響　F．蛋白質(zhì)可看作一個(gè)多價(jià)離子,,蛋白質(zhì)等電點(diǎn)--在某一pH值，蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，凈電荷為零。這一pH稱為蛋白質(zhì)等電點(diǎn),,,等離子點(diǎn)--沒(méi)有其他鹽類干擾時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)界離出來(lái)的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子 受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH稱等離子點(diǎn)。特征常數(shù)。,二．蛋白質(zhì)分子的大小與形狀,㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量,,㈥．利用SDS聚

3、丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量,蛋白質(zhì)在各種介質(zhì)中（PAGE）電泳時(shí)，它的遷移率,,,這樣造成兩個(gè)后果：,?、佟DS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過(guò)蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。　　　因此，所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時(shí)均以同樣的電荷/蛋白質(zhì)比向正極移動(dòng)?！、?改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。,,SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長(zhǎng)橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長(zhǎng)軸長(zhǎng)度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地

4、變化。電泳遷移率μ與多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)有下列關(guān)系,,(七) 毛細(xì)管電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量 毛細(xì)管電泳（CE）則可以在很大程度上克服常規(guī)方法時(shí)間長(zhǎng)、靈敏芽低不利情況。用毛細(xì)管電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量?jī)H需要納克量蛋白質(zhì)，而且還可以用積分儀或電腦聯(lián)機(jī)精確定量。,(八)質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量是近年來(lái)發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，其分辨率和精確度都較前幾項(xiàng)技術(shù)高。尤其近幾年發(fā)展起來(lái)的磁質(zhì)譜可精確測(cè)定分子質(zhì)量2000

5、Da以下的多肽；而電噴霧質(zhì)譜（ESI）可以測(cè)5萬(wàn)Da的蛋白質(zhì)，而且只需要皮摩爾（pmol）量的蛋白質(zhì)，精確度為0.01%。,三．蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀,1．蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)溶液是分散系統(tǒng)：分散相是蛋白質(zhì)分子顆粒，分散介質(zhì)是水。分散程度-------膠體系統(tǒng)分散相質(zhì)點(diǎn)--------真溶液（質(zhì)點(diǎn)是分子，均相系統(tǒng)）,,分散程度--以分散相質(zhì)點(diǎn)的直徑來(lái)衡量 根據(jù)分散程度：,,分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定需三個(gè)條件：

6、,a． 分散相質(zhì)點(diǎn)1-100nmb． 分散相質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，互相排斥不聚成顆粒而沉淀c． 分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層,蛋白質(zhì)：,a. 膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍 c． 丁達(dá)爾效應(yīng)d． 布朗運(yùn)動(dòng)e． 不能透過(guò)半透膜,2．蛋白質(zhì)的沉淀,,,沉淀蛋白質(zhì)的方法：,① 鹽析法： 中性鹽（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白質(zhì)脫去水化層優(yōu)點(diǎn)：不引起蛋白質(zhì)變性② 有機(jī)溶劑沉淀法：極性有機(jī)溶

7、劑（甲醇，乙醇，丙酮）－→脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用 條件：低溫操作 縮短時(shí)間,③ 重金屬鹽沉淀法,當(dāng)溶液pH>pI,蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷,易與重金屬離子 　 　　　　　　　　　　　　　(Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀用途：搶救誤服重金屬鹽的病人,④　生物堿試劑和某些酸類沉淀法,生物堿試劑－－能引起生物堿沉淀的一類試劑 當(dāng)溶液pH<

8、pI時(shí),蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷→ 易與生物堿試劑,酸根負(fù)離子反應(yīng)→沉淀用途：臨床除去體液中干擾測(cè)定的蛋白質(zhì),⑤　加熱變性測(cè)定法,原因：a． 加熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，損壞了水化層b． 蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)破壞了帶電狀態(tài)。用途：制豆腐（加熱+少量鹽鹵）,,四 蛋白質(zhì)分離提純的一般原則, 蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)--增加制品純度或比活性、幾增加單位蛋白質(zhì)質(zhì)量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性。,,① 前處理：,,,材料獲

9、得：,（一）天然材料：新鮮，含量豐富，易于提取，價(jià)格便宜。 e.g.鈣調(diào)素：動(dòng)物的腦組織，植物花粉 胰蛋白酶抑制劑：大豆種子 溶菌酶：雞蛋清 抗體：血清（二）基因工程產(chǎn)物：對(duì)于天然不易得到的蛋白，通過(guò)工 程菌或工程細(xì)胞表達(dá)而獲得。,② 粗分離,蛋白質(zhì)混合提取液∣∣鹽析法、等電沉淀、有機(jī)溶劑↓所要蛋白質(zhì)與其他雜

10、蛋白質(zhì)分開(kāi)特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜，又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。,粗分離,（一）破細(xì)胞動(dòng)物，植物細(xì)胞：勻漿，研磨大腸桿菌：凍融，超聲，溶菌酶,（二）抽提 1. pH：選擇合適pH的緩沖液，如Tris，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽緩沖體系，保證待分離蛋白在此pH條件下穩(wěn)定。一般緩沖液濃度為20－50mM。 2.溫度：低溫如4－10℃，蛋白酶活性較低。 3.離子強(qiáng)度：如0.1－0.2 M NaCl或KCl.

11、4.其他成分：還原劑如NaHSO4，維生素C；巰基保護(hù)劑DTT，巰基乙醇；金屬螯合劑EDTA，EGTA；蛋白酶抑制劑PMSF。,（三）初步分離 1.分離細(xì)胞器：離心，超離心 2.除核酸：酶法DNase,RNase；超聲 3.除脂肪：丙酮，脂肪酶（四）粗分蛋白 1.鹽析：NaCl，(NH4)2SO4沉淀 2.有機(jī)溶劑抽提：甲醇，乙醇，丙酮 3.等電點(diǎn)沉淀：除去雜蛋白 4.熱變性：

12、除去雜蛋白（五）除鹽 1.超濾 2.凝膠過(guò)濾 3.凍干,③ 細(xì)分離,,,,④ 結(jié)晶：本身伴隨著一定程度的提純　重結(jié)晶：可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)純度愈高、溶液愈濃就愈容易結(jié)晶,,五 蛋白質(zhì)混合物的分離方法,,(一）據(jù)分子大小不同的分離方法,1．透析和超過(guò)濾 利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、單糖、水等分開(kāi)。,,,,,超過(guò)濾 利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分

13、子通過(guò)半透 膜，而蛋白質(zhì)留在膜上。,2 密度梯度（區(qū)帶）離心,原理,,3 凝膠過(guò)濾,（凝膠過(guò)濾層析，分子排阻層析）（分子篩層析，凝膠滲透層析）-------根據(jù)分子分離蛋白質(zhì)混合物,⑴ 凝膠過(guò)濾的介質(zhì),常用介質(zhì)：(1) Sephadex: (交聯(lián)葡聚糖) G25, G50, G75, G100 Bio-gel: (聚丙烯酰胺) P-6，P-30，P-60，P-100 Sepharose: (瓊脂糖) 2B, 4

14、B, 6B(2) Sephacryl: S100, S200, S300(3) Superose: HPLC(4) superdex: HPLC,凝膠珠--多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)度or孔度（網(wǎng)孔大小）－－決定凝膠的分級(jí)范圍，即能被該凝膠分離開(kāi)來(lái)的蛋白質(zhì)混合度的分子量范圍。排阻極限－－表示分級(jí)范圍的上限，不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠珠微孔的最小分子量的分子量。,,凝膠粒度--篩眼（目）數(shù)，珠直徑表示∣－－→ 與洗脫流速，分辨率有

15、關(guān),,⑵　凝膠過(guò)濾的原理,當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外。隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動(dòng)并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。,不同分子大小路徑不同  大分子--先洗脫出來(lái)小分子--后洗脫出來(lái),有關(guān)凝膠柱體積的術(shù)語(yǔ),　Vt為凝膠柱床的總體積（total volume），常稱柱床體積。它可以用水直接測(cè)量或按幾何形狀

16、計(jì)算而得。Ve為某一溶質(zhì)組分的洗脫體積（elution volume）。它是自加樣開(kāi)始到該組分的洗脫峰或洗脫峰上升邊緣的半高點(diǎn)出現(xiàn)使所流出的體積。,V0為孔隙體積（void volume）或稱外體積（outer volume）或外水體積。測(cè)定不能被凝膠滯留的大分子溶質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖（blue dextran，分子量約200 000）的洗脫體積可以決定V0。直徑均勻的剛性球形顆粒的柱床V0約等于0.35Vt。Vi為內(nèi)體積（inner

17、volume）或稱水體積，它可由于膠克重乘其吸水值（以毫升/克表示）近似地表示，或直接測(cè)出凝膠柱小分子物質(zhì)（如T2O，tritium oxide）通過(guò)的洗脫體積再減去外體積得來(lái)。,,Vm為凝膠基質(zhì)體積（matrix volume）。凝膠床內(nèi)各種體積之間的關(guān)系是：Vt= V0+ Vi + Vm 其中，（Vi+ Vm）亦即（Vt-V0）是凝膠珠的總體積。,,假定凝膠與待分離的溶質(zhì)之間不存在相互作用，那么凝膠過(guò)濾可以看成

18、是一種液-液分配層析。凝膠珠內(nèi)的水相是固定相（Vi），凝膠珠外的水相是流動(dòng)相（V0），溶質(zhì)在Vi和V0之間分配。能進(jìn)入Vi的溶質(zhì)的量決定于它的大小和凝膠孔的大小。溶質(zhì)在柱中的移動(dòng)速度取決與它在兩相之間的分配系數(shù)（Kd）：,,,Kd是溶質(zhì)分子大小的函數(shù)，而與凝膠床的幾何形狀無(wú)關(guān)。對(duì)于完全被排阻在凝膠珠內(nèi)外的大分子來(lái)說(shuō)，它們將在同一洗脫峰出現(xiàn)，Ve = V0 ，Kd=0；對(duì)于完全能自由出入凝膠珠內(nèi)外的小分子，Ve = V0 + Vi ，Kd

19、=1；對(duì)于在分級(jí)范圍內(nèi)的中等分子，凝膠珠內(nèi)部的有些微孔它們能擴(kuò)散進(jìn)去，有些則不能，因此一般情況下，Kd總是在0與1之間。,,但有時(shí)發(fā)現(xiàn)Kd＞1，這表明凝膠對(duì)溶質(zhì)有吸附作用。整理上式得：Ve= V0 +Kd Vi 從這個(gè)式子可以看出，某一溶質(zhì)的Kd就是該溶質(zhì)能擴(kuò)散進(jìn)入珠內(nèi)的空間部分占其總空間（Vi）的分?jǐn)?shù)。,,由于實(shí)際測(cè)定Vi有困難，所以上述的公式很少使用。經(jīng)修正，用凝膠珠內(nèi)的總體積代替上式中的內(nèi)體積（Vi）來(lái)表示Kd

20、，此時(shí)Kd改用Kav，稱可用分配系數(shù)（avaliable coeffient）：,,,只要測(cè)得Vt，V0和Ve，即可計(jì)算Kav值。對(duì)于兩種不同分子量和不同Kav值（K‘a(chǎn)v和K’‘a(chǎn)v）的組分,它們的洗脫體積之差： Vs=V'e-V"e=（K'av-K"av）（Vt-V0）因此,為了完全分開(kāi)兩種組分,樣品的體積一定不能大于Vs。上面這個(gè)式子可以用來(lái)計(jì)算某一提純過(guò)程的最適柱

21、床體積。,處理介質(zhì)↓裝柱↓平衡↓上樣↓洗滌↓洗脫↓介質(zhì)再生,層析的一般步驟,(二)利用溶解度差別的分離方法,等電點(diǎn)沉淀和pH控制蛋白質(zhì)處于pI時(shí)，凈電荷為零。沉淀溶解度最低pH>pI 蛋白質(zhì)帶電，溶解度較大pH<pI,,,,,,1．             

22、不同蛋白質(zhì)∣↓等電點(diǎn)不同∣∣ pI時(shí)溶解度最低↓將蛋白質(zhì)彼此分開(kāi),2．蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析, 中性鹽對(duì)球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響低濃度時(shí)，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度 鹽溶作用機(jī)理：蛋白質(zhì)吸附鹽類離子，帶電表層使蛋白質(zhì)分子被此排斥，蛋白質(zhì)與水分子的作用加強(qiáng)，溶解度提高。同樣濃度（摩爾數(shù)/升）的兩價(jià)離子的中性外，如MgC

23、l2 \（NH4）2SO4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響效果，要比單價(jià)離子的中性鹽如NaCl,NH4Cl大得多。,,鹽析－－當(dāng)離子強(qiáng)度增加到足夠高時(shí)，eg.飽和或半飽和程度，很多蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來(lái)，這種現(xiàn)象叫鹽析。原理－－大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來(lái)的溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。鹽析法－－分離、提純常用方法。保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。（NH4）2S

24、O4,3.有機(jī)溶劑分級(jí)法,,,作用原理：,①.有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)，增加了兩個(gè)相反電荷之間的吸引力，。蛋白質(zhì)的表面可離解基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。②.有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。,聚乙二醇（水溶性非離子聚合物）可致使蛋白質(zhì)沉淀。原理：脫去蛋白質(zhì)的水化層；聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水基團(tuán)發(fā)生相互作用，并在空間上阻礙蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度與鹽濃

25、度，pH，及絕對(duì)溶解度無(wú)關(guān)。其溶解度依賴于聚乙二醇的分子量。,4．溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響。,0-40攝氏度 大部分球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增大40-50攝氏度 大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定,開(kāi)始變性大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定,蛋白質(zhì)的操作在0攝氏度或更低溫度下進(jìn)行.,,糜蛋白酶,胰蛋白酶及其前體的制備,(三)根據(jù)電荷不同的分離方法,根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。 1．

26、電泳 在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子，將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱電泳(elecctropHoresis)或離子泳(ionpHoresis)。,,或從方法學(xué)的角度給電泳下定義，電泳是在外電場(chǎng)存在下，利用分子攜帶的凈電荷不同分離分子混合物的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽、蛋曰質(zhì)、核苷酸和核酸等生物分子的分離分析和制備。,,帶電顆粒在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度主要決定于它所帶的凈電荷量以及顆粒的大小和形

27、狀。顆粒在電場(chǎng)中發(fā)生泳動(dòng)時(shí)，將受到兩種方向相反的力的作用：F(電場(chǎng)力)=qE(=qU/s)Ff(摩擦力)=fv,,這里，q＝顆粒所帶的電量E＝電場(chǎng)強(qiáng)度或電勢(shì)梯度＝U/qU＝兩電極間的電勢(shì)差(以伏特表示)S= 兩電板之間距離(以厘米表示)f＝摩擦系數(shù)(與顆粒的形狀，大小和介質(zhì)的粘度有關(guān))v＝顆粒泳動(dòng)速度(以厘米／秒表示,,當(dāng)顆粒以恒穩(wěn)速度移動(dòng)時(shí)，則F-Ff=0，因此，qE=Fv，

28、即，v/E=q/f 在一定的介質(zhì)中對(duì)其一種蛋白質(zhì)禾說(shuō)，q/F是一個(gè)定值，因而v/E月也是定值，它被稱為遷移率或泳動(dòng)度：u=v/E,,u值可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得，蛋白質(zhì)的u值為0.1*10-4 --1.0*10-4 厘米2·伏特-1·秒-1。蛋白質(zhì)的泳動(dòng)度以及pH和離子強(qiáng)度對(duì)泳動(dòng)度的影響都反映某一特定蛋白質(zhì)的特性。因此電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純廈的重要手段而且也是研究

29、蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的一種物理化學(xué)方法。,電泳基礎(chǔ)：自由電泳（移動(dòng)界面電泳）, a.先在u-形管內(nèi)使蛋白質(zhì)溶液和緩沖液之間形成清晰的界面b.加電場(chǎng)c.由于界面處存在濃度梯度，因而產(chǎn)生折射率梯度。利用光學(xué)系統(tǒng)可以觀察到界面的移動(dòng)。每個(gè)移動(dòng)界面相當(dāng)于一個(gè)特定蛋白質(zhì)。,區(qū)帶電泳,是由于在支持物上電泳時(shí)各組分因遷移數(shù)度不同分布成區(qū)帶而得名。按支持物介質(zhì)的物理性狀：四類區(qū)帶電泳：1.濾紙電泳.薄膜電泳(醋酸纖維薄膜電泳, 薄膜

30、電泳)2.粉末電泳:淀粉.纖維層.硅膠粉3.細(xì)絲電泳:尼龍絲,人造絲4.凝膠電泳:聚丙烯酰胺.瓊脂糖凝膠,,,盤狀電泳,在區(qū)帶電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。支 持 物－－聚丙烯酰胺凝膠,,,三種物理效應(yīng)：1。樣品的濃縮效應(yīng)2。凝膠對(duì)分子的篩選效應(yīng)3。電泳分離的電荷效應(yīng)樣品分離效果好、分辨率等。,等電聚焦（電聚焦）,蛋白質(zhì)混合物的分離是在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液介質(zhì)固體化、

31、操作方便、分離快蛋白質(zhì)"聚焦"在等于其等電點(diǎn)的pH點(diǎn)處，形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。,雙向電泳--AA混合物一次電泳不能完全分開(kāi),將第一次電泳分開(kāi)的斑點(diǎn)通過(guò)支持介質(zhì)間的接觸吸印轉(zhuǎn)移到第二個(gè)支持介質(zhì)上,旋轉(zhuǎn)90℃進(jìn)行第二次電泳,稱雙向電泳.優(yōu)點(diǎn):設(shè)備簡(jiǎn)單.操作方便,樣品用量少,1975年，O’Farrell 首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來(lái)此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前

32、，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來(lái)越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。 雙向電泳由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)組成，第一向使等電點(diǎn)不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。,2． 離子交換層析,原理：根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異將不同蛋白質(zhì)分開(kāi)。離子交換介質(zhì)： (1)離子交換樹(shù)脂 (2)離子交換纖維素 (3)Sepharose

33、Fast Flow: (4)Sepharose High Performance：分辨率較F.F.高 (5)Mono: HPLC,I 分類： 陰離子交換 強(qiáng)度 功能基團(tuán) + DEAE 中等 －OCH2CH2NH(CH2CH3)2

34、 + QAE 強(qiáng) －OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3 陽(yáng)離子交換 強(qiáng)度 功能基團(tuán) CM 弱 －OCH2COO- SP

35、 強(qiáng) －CH2CH2CH2SO3-II 選擇： i 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)選擇介質(zhì) ii 根據(jù)分離目的選擇介質(zhì),例如： 離子交換纖維素――纖維素為交換基質(zhì)原理：具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，吸較大的表面積，大分子可以自由通過(guò)優(yōu)點(diǎn)：　交換容量大　　　洗脫條件溫和　　　　　回收率高　　　品種多，選擇范圍廣,離子交換葡聚糖――基質(zhì)：交聯(lián)葡聚糖　優(yōu)點(diǎn)：交換容量比離子交換纖維素大3－4倍?！?/p>

36、能根據(jù)　凈電荷　　　　　　分子大小　　　分離,,蛋白質(zhì)混合物的分離由　　 溶液中的鹽離子強(qiáng)度　　pH　　　　　　　　　　　　 來(lái)完成結(jié)合力小蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來(lái)洗脫時(shí)　　保持洗脫劑成分不改變　　　　　改變洗脫劑的鹽濃度、PH值,,跳躍式分段改變（分段洗脫）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　漸進(jìn)式連續(xù)改變（梯度洗脫）梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：　分離效果好　　　　

37、　　　　分辨率高適合：交換容量小，對(duì)鹽敏感的離子交換劑,,兩種混合器:　 簡(jiǎn)單型混合器 復(fù)合型混合器,,注意的問(wèn)題： (1) 緩沖液的選擇： 陽(yáng)離子：Tris 陰離子：磷酸鹽，檸檬酸鹽 (2) 介質(zhì)處理： 陽(yáng)離子： Na+ 型 陰離子： Cl- 型 (3) 洗脫：原理：i改變鹽濃度 ii改變pH值方式：i分步洗脫 ii梯度洗脫 (

38、4) 介質(zhì)再生,（四）蛋白質(zhì)的選擇吸附分離,吸附層析--利用吸附力的強(qiáng)弱不同而達(dá)到分離的目的。吸附劑--結(jié)晶磷酸鈣及羥基磷灰石蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電荷的基團(tuán)，與羥基磷灰石的鈣離子結(jié)合。用磷酸緩沖液羥基磷灰石--分離核酸：病毒。活性C 硅酸 AL2O3磷酸鈣--吸附層析,（五）根據(jù)對(duì)配基的生物學(xué)特異性的分離方法--親和層析,基礎(chǔ)： 基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（它與另一種稱配基的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合）配基：能被生物

39、大分子所識(shí)別并于之結(jié)合的原子，原子團(tuán)，和分子：酶--底物;激素--受體；抗原：抗體。,原理,先把待提純的某一蛋白質(zhì)的特異配基，通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面的功能基上，在配基與多糖基質(zhì)間遷入一個(gè)連接臂使配基于凝膠之間保持足夠的距離，不改變載體表面的空間位阻妨礙等待分離的大分子與其配基的結(jié)合。,,,待提純的蛋白質(zhì)樣品+多糖材料↓待提純的蛋白質(zhì)樣品與配體結(jié)合，吸附，在瓊質(zhì)糖顆粒上

40、↙↘結(jié)合在柱上的蛋白其它蛋白可以用自由配體的分子溶液脫下來(lái),1 原理：利用蛋白質(zhì)特異性進(jìn)行分離。2 介質(zhì)準(zhǔn)備： 載體選擇：Sepharose 4BSepharose CL4B,Sepharose Fast Flow,Sepharose High Performance 空間臂：偶聯(lián)小分子時(shí)需要空間臂，常為雙功能基團(tuán)，如己二氨或ε－氨基己酸。,3 配基選擇： 抗原――抗體，酶―

41、―抑制劑，酶――底物，激素――受體，金屬結(jié)合蛋白――螯和劑， 含巰基蛋白――Hg或含巰基分子，凝集素――糖蛋白4 偶聯(lián)： I 溴化氰法：與α－氨基或ε－氨基偶聯(lián)。 效率高，反應(yīng)時(shí)間短，條件溫和，適于多種蛋白。 II 環(huán)氧氯丙烷法：與－NH2, ―OH, ―SH 偶聯(lián) 偶聯(lián)時(shí)需強(qiáng)烈條件，如pH11，40－50℃，適于特別穩(wěn)定的蛋白,,,六．蛋白質(zhì)含量的測(cè)定與純度的鑒定,分析工作： （一）測(cè)定蛋白質(zhì)的

42、總量；（二）測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量；（三）鑒定最后制品的純度。 （四）活性測(cè)定,（一）濃度/含量測(cè)定 1 紫外法：蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸在280nm 有吸收。 2 Lowry法：蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族氨基酸還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍(lán)色。 3 Bradford法：蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)染料的結(jié)合量。 4 凱氏定氮法 5 雙縮脲法,（二）測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某

43、一特定蛋白質(zhì)的含量,--具有高度特異性的生物學(xué)方法酶活性激素活性抗原-抗體,（三）蛋白質(zhì)制品純度的鑒定,1 電泳法： SDS－PAGE， IEF 2 化學(xué)法： N端測(cè)定， C端測(cè)定 3 儀器法： HPLC，質(zhì)譜，氨基酸組成分析 4 物理方法： 沉降分析 擴(kuò)散分析,（四）活性測(cè)定,1 激酶：標(biāo)記ATP 2 磷酸化酶：定磷

44、 3 利用靶酶活性 4 氧化還原酶 5 ELISA,溶菌酶： 分子量為14KD， 等電點(diǎn)為11，耐熱，能夠水解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁，雞蛋清中含量豐富。,舉例：從雞蛋殼膜中制備溶菌酶,純化步驟：150克雞蛋殼，1％ NaCl—0.05 N HCl ,40℃抽提↓20％醋酸調(diào)pH4.6，75℃處理3分鐘，離心取上清↓加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量50％的CaCl2，離心取上清↓在上清中加NaC

45、l至終濃度5％，將樣品加到Sephadex G-50層析柱中(5X25cm)，0.6% NaCl洗脫，流速40毫升/小時(shí)，收集洗脫液5ml/管↓測(cè)活，合并含溶菌酶部分↓聚乙二醇濃縮↓結(jié)晶,蛋白質(zhì)的分離純化小結(jié),1 材料獲得： 天然獲得新鮮，含量豐富，易于提取，價(jià)格便宜。； 基因工程手段獲得對(duì)于天然不易得到的蛋白，通過(guò)工程菌或工程細(xì)胞表達(dá)而獲得。2 粗分離： 除去大量雜質(zhì)和雜蛋白，初步濃縮目的蛋白。,3 細(xì)分離：