第六章 獸藥殘留檢測技術2011

1、第六章 獸藥殘留檢測技術,第一節(jié) 獸藥殘留,使用獸藥的目的,防治食品動物疾病促進生長提高飼料利用率,獸藥的使用情況,據(jù)1966~1974年統(tǒng)計,美國大約已有78%~80%的食品動物,在其一生中或多或少服用過藥物。,獸藥的殘留,獸藥殘留是指動物性產(chǎn)品的任何可食部分含有獸藥母化合物或其代謝物。獸藥最高殘留限量（MRL）：是指某種獸藥而在食物中或食物表面產(chǎn)生的的最高允許獸藥殘留量（單位μg/kg, 以鮮重計）。獸藥殘留主要是由于各

2、種正常用藥和藥物濫用造成的,另外,休藥期過短, 是造成動物性食品獸藥殘留過量的另一個重要原因。休藥期：是指自末次給藥到動物允許屠宰或其動物性產(chǎn)品（乳、蛋等）獲準上市的間隔時間。,獸藥的危害,引起過敏、致畸、致突變及致癌等不良反應。,立法,為防止動物性食品中可能出現(xiàn)的藥物殘留損害人體健康,1984年在CAC的倡導下由聯(lián)合國糧農組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合發(fā)起組織了食品中獸藥殘留立法委員會(CCRVDF)。CCRVDF的主

3、要宗旨是:為控制食品中的獸藥殘留,篩選并建立適用于全球的獸藥及其他化學物殘留的分析方法和取樣方法;對獸藥殘留進行毒理學評價;按制訂世界或地區(qū)性法規(guī)標準 (Codex Standart)的8個步驟,制定動物組織及產(chǎn)品中獸藥最高殘留限量(MRL)法規(guī)及休藥期法規(guī)。,一、常見獸藥,,,按用途分類,抗微生物藥,抗寄生蟲藥,激素類藥物,生長促進劑,,抗菌藥：磺胺藥、呋喃類藥、喹諾酮類,抗病毒藥：干擾素,抗蠕蟲藥,抗原蟲藥,殺蟲藥,,抗生素：青霉素

4、、鏈霉素、氯霉素,1、抗微生物藥,抗微生物藥是指對病原微生物(細菌、真菌、支原體、病毒等)具抑制或殺滅作用,主要有用于全身感染的抗生素、磺胺藥及其他化學合成抗菌藥。,根據(jù)化學結構可分類為:,(1)氨基糖苷類： 鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、安普霉素等。(2) β-內酰胺類： 青霉素、頭孢菌素等。(3)四環(huán)素類： 土霉素、金霉素、多西環(huán)素等。(4)氯霉素類： 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。 (5)大環(huán)內酯類： 紅霉

5、素、吉他霉素、泰樂菌素等。(6)林可胺類： 林可霉素、克林霉素。(7)多肽類： 桿菌肽、黏菌素等。,,(8)多烯類：兩性霉素、制霉菌素等。(9)磺胺類及抗菌增效劑： 磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺異唑、磺胺甲基異唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶等。(10)硝基呋喃類：呋喃西林、呋喃他酮、呋喃要因、呋喃唑酮等。(11)喹諾酮類：萘啶酸、吡哌酸、嗯喹酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、奧比沙星、沙拉沙星、馬波沙星等。,,2、抗寄生蟲藥,抗寄生

6、蟲藥是指能殺滅或驅除動物體內外寄生蟲的藥物。畜禽寄生蟲病的危害性極大,會給國民經(jīng)濟造成無法估量的巨大經(jīng)濟損失。寄生蟲病不僅引起大批畜禽死亡,而且嚴重影響動物生長率,使乳、肉、蛋、毛、革等畜產(chǎn)品質量下降,數(shù)量減少。某些人畜共患寄生蟲病,還能直接威脅人類的健康和生命安全。,根據(jù)藥物作用的特點，抗寄生蟲藥可分為:,(1)抗蠕蟲藥： 苯并咪唑類、咪唑并噻唑類、有機磷酸酯類、四氫嘧啶類、水楊酰苯胺類、阿維菌素類、哌嗪衍生物等。(2

7、)抗原蟲藥： 聚醚類離子載體抗生素、三嗪類、二硝基類、氯羥吡啶。(3)殺蟲藥： 有機磷化合物、擬除蟲菊酯類化合物等。,,3、激素與其他生長促進劑,(1)性激素動物生產(chǎn)中使用的性激素,包括雌性激素(如:雌二醇、己烯雌酚(己烷雌酚、甲地孕酮、雌烯酮等)和雄性激素(如:甲基睪丸酮、丙酸睪酮、氯睪酮)。(2)生長激素 是由動物腦垂體分泌的天然蛋白質激素,主要通過促進蛋白質合成和脂肪分解來促進動物生長,增加瘦肉率,提高飼

8、料轉化率。目前在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用的主要有牛生長激素(BST)和豬生長激素(PST)。,,(3)甲狀腺素,類甲狀腺素及抗甲狀腺素。(4)人工合成的蛋白質同化激素 人工合成的蛋白質同化激素可促進動物腦下垂體生長激素的分泌。與抗生素一樣,伴隨著激素活性物質在畜禽生產(chǎn)中的使用種類和數(shù)量的不斷增加,反對使用的呼聲也越來越高。(5)鎮(zhèn)靜劑和β-腎上腺素阻斷劑 為了控制被運輸及等待屠宰的動物的緊張,有些畜牧業(yè)會非法使用鎮(zhèn)靜劑和腎上腺素阻

9、滯劑。因為豬對于它們所處環(huán)境的突然變化特別敏感,隨之產(chǎn)生的新陳代謝和緊張會影響肉的質量。,二、常見獸藥殘留的種類與危害 1. 抗生素類藥物,多為天然發(fā)酵產(chǎn)物, 是臨床應用最多的一類抗菌藥物, 如青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類、四環(huán)素類、螺旋霉素、鏈霉素、土霉素、金霉素等。,2. 磺胺類藥物,主用于抗菌消炎, 如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶, 磺胺瞇, 菌得清、新諾明等。近年來, 磺胺類藥物在動物性食品中的殘留超標現(xiàn)象, 在所有獸藥當中是

10、最嚴重的。,3. 硝基呋喃類藥物,主用于抗菌消炎, 如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。,4. 抗寄生蟲類藥物,主要用于驅蟲或殺蟲, 如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑類抗寄生蟲藥物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。,5. 激素類藥物,主要用于提高動物的繁殖和加快生長發(fā)育速度, 使用于動物的激素有性激素和皮質激素。而以性激素(包括多種內源性性激素、人工合成的類似性激素的類固醇化合物、人工合成的

11、具有性激素某些特性的非類固醇化合物) 最常用, 如孕酮、睪酮、雌二醇、甲基睪酮, 丙酸睪酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。,二、食物中獸藥殘留,(1)獸藥殘留獸藥殘留是指動物產(chǎn)品的任何食用部分所含獸藥的母體化合物及其代謝物，以及與獸藥有關的雜質的殘留。,(2)獸藥殘留的來源,在食品動物體內或動物性食品中發(fā)現(xiàn)的違章殘留,大都是由用藥錯誤造成的,其原因主要有:①不正確地應用藥物,如用藥劑量、給藥途徑、用藥部位和用藥動物的種類等不符合用藥指示

12、,這些因素有可能延長藥物殘留在體內的時間,從而需要增加休藥的天數(shù);②在休藥期結束前屠宰動物;③屠宰前用藥掩飾臨床癥狀,以逃避屠宰前檢查;④ 以未經(jīng)批準藥物作為添加劑飼喂動物;,,⑤藥物標簽上的用法指示不當,造成違章殘留物;⑥飼料粉碎設備受污染或將盛過抗菌藥物的容器用于貯藏飼料;⑦接觸廄舍糞尿池中含有抗生素等藥物的廢水和排放的污水(如豬經(jīng)常攝入這種污水);⑧任意以抗生素藥渣喂豬或其他食品動物等濫用抗生素,是出現(xiàn)抗生素殘留的主要

13、原因。,(3)獸藥殘留的種類(形式),第一類是以游離或結合形式存在的原藥及其主要代謝物(除高親脂性化合物外),因代謝和排泄迅速,不會在動物體內蓄積。但這些物質可能具有毒性作用,而且被人攝入后在體內可生成高度活化的中間產(chǎn)物(親電子基團、自由基等),因而對消費者具有潛在的危害性。第二類是共價結合代謝物,因其從機體排出相對較慢,它們的存在對于靶動物有潛在的毒性作用,而對于消費者,由于結合殘留在人體內不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能

14、只顯示很低的毒性。,,殘留毒理學意義較大的獸藥按其用途分類主要包括:抗生素類、合成抗菌素類、抗寄生蟲類藥、生長促進劑和殺蟲劑等?？股睾涂咕亟y(tǒng)稱抗微生物藥物,是最主要的獸藥添加劑和獸藥殘留,約占藥物添加劑的60%。,(4)影響食品動物組織中藥物殘留的因素,經(jīng)內服或注射給藥的動物,其組織中存在的藥物及其代謝物或降解產(chǎn)物的殘留。組織中藥物殘留隨藥物種類、劑量、給藥途徑、藥物及其代謝物特性的不同而異。在有些情況下,飼料也會影響動物組

15、織中的藥物殘留,但藥物休藥期的執(zhí)行情況是影響組織殘留的最重要因素。屠宰后胴體加工過程也是影響藥物殘留檢出率的因素之一。烹調和貯藏溫度亦影響殘留藥物在組織中的穩(wěn)定性。,,對于大多數(shù)抗微生物藥來說,藥物從動物體內消除屬一級動力學,而大多數(shù)組織中藥物殘留抗微生物活性的喪失是一個零級動力學過程。這表示藥物殘留量越多,它們從食用組織中消除所需的時間就越長。如果藥物添加劑是親脂性的,那么它們會蓄積在脂肪組織中,而且其消除速度明顯比親水性藥物慢

16、。實際上,存在于家禽食用組織、牛肉、羊肉、乳和蛋中的藥物殘留的種類和發(fā)生率差異較大。這是動物屠宰前或其乳和蛋上市前停止用藥時間長短的一種反映。,四、獸藥殘留的現(xiàn)狀與法規(guī),獸藥殘留主要是由于不合理使用藥物治療動物疾病和作為飼料藥物添加劑而引起的。1990年出口日本的1萬噸肉雞,由于檢測出抗球蟲藥氯羥吡啶的殘留量超標,要求我國政府銷毀所有產(chǎn)品,給我國造成很大經(jīng)濟損失。出口到德國的蜂蜜由于農藥“殺蟲脒”殘留超標而被退貨,接著歐共體、美國

17、、日本也相繼拒絕進口我國蜂蜜,使我國蜂蜜在世界市場上的銷售發(fā)生嚴重因難。1998年4月,從內地出口到香港的生豬,其內臟食后導致17人中毒。其原因是內臟中含有違禁藥“鹽酸克侖特羅”。此外,我國出口的畜禽產(chǎn)品還多次出現(xiàn)安眠酮類、雌性激素、抗生素等藥物殘留超標而被取消出口的事件。,,1995年、1996年,歐盟獸醫(yī)委員會派員對我國進行了考察和評估,認為我國的獸醫(yī)衛(wèi)生狀況達不到歐盟的要求,于是做出了從1996年8月1日起,禁止從我國進口禽肉

18、的決定。1997年、1998年歐盟又派員來華考察,結果仍達不到其要求。目前,我國肉、蛋、奶的出口形勢仍相當嚴峻。我國已開始重視動物性食品中的獸藥殘留問題,制訂了各種獸藥殘留的法律和法規(guī),修訂了《動物性食品中獸藥殘留最高限量標準》,并開始建立了全國范圍的獸藥殘留監(jiān)控體系。,,,第六章 獸藥殘留檢測技術,第二節(jié) 樣品前處理,,樣品前處理是指樣品的制備和對樣品中的待測組分進行提取、凈化、濃縮的過程。樣品前處理的目的是消除基質干擾、保

19、護儀器、提高檢測方法的靈敏度、選擇性、準確度、精密度。不同樣品前處理方法的選擇，需要根據(jù)樣品中危害殘留物質的特點。殘留分析中的樣品主要是各種食用組織(肌肉、脂肪、肝、腎、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)?；铙w檢測中一般采集血漿、尿液和糞便;屠宰場主要采集某種藥物的靶組織及其他高濃度的樣本,如肝、腎、膽汁、注射部位的組織等。,一、生物樣品的類型,獸藥殘留分析中,最常用的生物樣品是組織樣品,其次是奶、血液和尿液樣品。(1)動物組織

20、肌肉(除去可見的脂肪)中水分約占75%,蛋白質(肌漿蛋白、肌原蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白)占19.0%、脂肪(中性脂肪、脂肪酸和磷脂)占2.5%、糖類1.2%,以及一些無機鹽、維生素和酶類。肌漿蛋白(肌紅蛋白、糖解酶)可溶于水,肌原蛋白(肌球蛋白、肌動蛋白)溶于濃鹽水,膠原蛋白和彈性蛋白(結締組織)在上述溶劑中均不溶。,,不同種類動物的食物構成和肌肉的成分,如家禽和牛的肌紅蛋白和脂肪含量存在差異,這些變化會影響分析方法的回收率或干擾檢

21、測,因此一種動物組織的殘留分析方法對其他動物組織樣品不一定適用。例如,用水提取雞肉和牛肉組織中呋喃唑酮,回收率在75%以上;同樣的方法提取豬肌肉樣品,回收率僅為10%,改用25%乙腈提取時回收率明顯提高,推測呋喃唑酮與豬肉中某種蛋白質結合較強。肝或腎組織為代謝或排泄器官,殘留物濃度高,消除緩慢,因此常被作為殘留檢測的靶組織。,(2)尿樣,尿液的主要成分是水、尿素及鹽類。它是一種良好的細菌培養(yǎng)基,因而需立即冷藏或防腐處理。冷藏條件一

22、般可置4℃ 冰箱內。若欲在室溫下保存,應在收集尿樣后,立即加入防腐劑。常用的防腐劑有甲苯、氯仿或改變尿液的酸堿性,以抑制細菌的繁殖。加入的防腐劑是否干擾測定或與被測組分發(fā)生化學反應,應由實驗驗證,以便選取合適的防腐措施。,,在所有體液樣品中,尿樣最容易獲得,并且樣品量多,內含藥物(母體藥物及代謝物)濃度高;正常尿液中僅含微量蛋白質,不需去蛋白處理。尿中藥物大多呈結合狀態(tài),主要以葡萄苷酸和硫酸酯結合物存在,因此無論直接測定或萃取分離

23、之前,都必須將結合態(tài)的藥物水解,使藥物游離出來。尿樣pH變化范圍大,分析前需調節(jié)到一致的pH值。,(3)血樣,血液采集好之后,由于激活了一系列凝血因子,血中的纖維蛋白原形成纖維蛋白,血液逐漸凝固,上層析出澄清的黃色液體稱為血清(serum)。分離血清時,可將凝結后的血液置離心機中離心,將上層血清轉入另外容器中保存,得到的血清,一般可占全血量的40%左右。,,若采血后立即將血液轉入有抗凝劑(常用肝素)的容器中,并輕輕搖勻,則血液不再凝

24、結,放置后血細胞會緩緩沉降,1~2h沉降完全,上層的黃色液體稱為血漿(plasma)。離心使上層血漿與下層血細胞充分分離,將血漿轉移至另一容器內供分析。血液通過抗凝獲得的血漿量,一般比血清稍多,接近全血量的50%。,,,,若抗凝血不離心,保持血漿和血細胞混合在一起,則稱為全血(whole blood)。全血樣品可冷凍貯存或直接供分析。全血樣品放置或自貯存處取出解凍之后,可明顯分為上、下兩層,上層為血漿,下層為血細胞,但輕微搖動即

25、可混勻。血漿和血清的化學成分與組織液相近,測定血漿或血清中藥物濃度,比全血更能反映作用部位藥濃的變化,測定方法一般也可互相通用。因為從抗凝血制備血漿的速度較快,并且分離出的血漿量比血清多,所以應用血漿比較方便;若血漿中含有抗凝劑對測定有影響,則應使用血清樣品。,,通常藥物在血漿中均與血漿蛋白(白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白)發(fā)生一定程度的結合,一些藥物甚至蛋白結合率可達90%以上。因此在萃取之前,必須將結合態(tài)的藥物游離出來。,(4)奶

26、樣,牛奶的含水量約87%,蛋白質(以酪蛋白為主)為3.3%,脂肪(甘油三酯)為3.7%,糖類(乳糖)為4.7%,以及一些無機鹽、維生素和酶類(過氧化物酶、脂肪酶等)。奶是一種復雜的非均相體系。乳脂球的主要成分為乳脂,表面包以由酪蛋白、類脂、酶、無機鹽和水分構成膜,使乳球能穩(wěn)定地懸浮在奶中并保護內部的乳脂免遭脂肪酶的水解,當劇烈振蕩時球膜被破壞,脂肪球即相互黏合析出。奶中還含有大量由酪蛋白或脂蛋白構成的膠束體系,當酸化或加熱時,膠束

27、結構解體,蛋白質沉淀析出。,,非解離性的或極性較低的藥物易由血漿向奶中擴散,導致奶中殘留。與血漿樣品類似,奶中的藥物可與蛋白質結合。因此在萃取之前,必須將結合態(tài)的藥物游離出來。,(5)蛋,禽蛋包括蛋黃和蛋清。蛋黃的含水量約50%、蛋白質16.5%、脂肪33%、糖類0.2%,以及一些無機鹽、維生素和酶類(淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和過氧化氫酶)蛋清含水量達88%,蛋白質10.5%和極少量的碳水化合物和脂肪。與蛋清相比較,蛋黃基

28、本上為疏水性環(huán)境,低極性藥物的殘留較多。,,如果需要分別測定蛋黃和蛋清中的殘留,最好將剛產(chǎn)出后的蛋分離蛋黃和蛋清,避免藥物由蛋黃向蛋清擴散。與尿液類似,蛋成分的pH變化范圍大,分析前需調節(jié)pH值。,二、樣品制備和貯存,樣品的制備方法，依據(jù)法規(guī)要求的不同和食品本身特性的差異而不同。有的要以全樣計,有的以脂肪計。一般來說是取可食部分制備樣品(除非有其他要求)。如對于肉類有的國家法枧規(guī)定要以脂肪計算食品安全危害物的量,有的要求以全樣來計

29、算。,,為保證取樣的準確性、減少污染和便于保存,對組織樣品宜分取一個完整解剖部分,如一個肝葉或一側完整的腎,小動物應摘取完整的臟器,并立即密封。樣品被絞碎或勻漿后進行縮分。生物樣品采樣后除立即分析外,都需要在適當條件下保存,目的是避免被測組分發(fā)生分解或產(chǎn)生其他化學變化。,貯存,冷凍保存是最常用的方法,一般冷凍溫度為-20℃,此時生物樣品如血漿、尿液和組織樣品均被凍凝,可以終止樣品中酶的活性,又可以貯存樣品。在某些情況下若收集的樣品來

30、不及冷凍處理,可先將其置冰屑中,然后再行冷凍貯存,臨用前再融化并放至室溫后供測定。,,對于一些易代謝的藥物,如磺胺類、聚醚類、同化激素,它們的肝和腎臟樣品不宜長期存放,理想的冷凍溫度應為-40℃~-80℃ 。為防止含酶樣品中被測組分進一步代謝,采樣后必須立即終止酶的活性。常采用的方法有:液氮中快速冷凍、微波照射、勻漿及沉淀、加入酶活性阻斷劑(通常加入氟化鈉)等。某些生物樣品中的藥物易被空氣氧化,如兒茶酚類中的阿樸嗎啡,具有鄰苯二酚結

31、構,易被空氣氧化產(chǎn)生醌類雜質,若收集的血漿樣品不加抗氧劑直接在-15℃ 冷藏,僅能穩(wěn)定4周;但加入抗壞血酸后,則可穩(wěn)定10周。,,冷凍時,若使用玻璃容器貯存樣品,需注意防止溫度驟降使容器破裂,造成樣品損失或污染。而塑料容器常含有高沸點的增塑劑,可能釋放到樣品中造成污染,而且還會吸留某些藥物,引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物還會被玻璃容器表面吸附,影響樣品中藥物的定量回收,因此,必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。,三、樣品均勻化,對

32、于血漿、奶、尿液樣品,可置渦旋混合器上混勻,以免造成測定誤差。對于肌肉、組織、糞便等半固體樣品都存在均勻化這一問題。其中肌肉和組織樣品可置勻漿機中均質,糞便樣品可加入少量甲醇或其他液體攪勻。同時還應注意取樣的代表性問題。,四、去蛋白處理,生物樣品如肝臟、腎臟、血漿等含有大量的蛋白質,它們能結合藥物,因此對于某些藥物的測定,必須先將與蛋白結合的藥物游離之后再作進一步處理。為什么要除去蛋白？？因為生物樣品含有大量的蛋白質,蛋白質在

33、測定過程中會形成泡沫、渾濁或出現(xiàn)沉淀而干擾測定。蛋白質還會污染儀器或惡化測定條件,如直接進樣用液相色譜分析含蛋白質的體液樣品時,蛋白質會沉積在色譜柱上,這不僅影響柱效,而且大大縮短色譜柱的使用壽命。目前已有很多去蛋白方法可供使用,但使用各種方法之前應了解該方法是否會導致生物樣品中的藥物發(fā)生分解或影響藥物的提取等。,,注意方法選擇,,通常去蛋白過程是將蛋白質變性處理后,把與蛋白結合的藥物解離出來,離心分離以除去蛋白。通常除蛋白的方法是

34、在含蛋白樣品中加入適當?shù)某恋韯┗蜃冃詣?使蛋白質脫水而沉淀(如有機溶劑、中性鹽),有的是由于蛋白質形成不溶性鹽而析出(如一些酸類:三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸),離心后取上清液用于分析。,1、有機溶劑沉淀,甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有機溶劑,尤以甲醇和乙腈為最常用。甲醇與蛋白形成絮狀沉淀易于離心分離,得到澄清的上清液;乙腈與蛋白形成致密沉淀,易離心除去,沉淀效率較甲醇高。使用時應加入足量的沉淀劑,通常加入量為樣品體積

35、的1.5~2倍。,2、酸性沉淀,常用的酸性沉淀劑有三氯醋酸和高氯酸,其他還有鎢酸、鉬酸、磷鎢酸、磷鉬酸和苦味酸等。酸性沉淀劑能同蛋白質的陽離子形成不溶鹽而沉淀,必要條件是溶液的pH要低于蛋白的等電點。加入沉淀劑之后立即形成白色沉淀(必要時可加熱使沉淀完全),離心后可得到澄明的上清液。,,三氯醋酸(常用10%溶液)沉淀蛋白的作用很強,因此最常使用,但應注意試劑中含有的雜質,將它們引入離心后的上清液中,可能會干擾藥物的分析。其次應注意

36、,當上清液再用乙醚等有機溶劑萃取時,三氯醋酸則連同溶入其內的雜質會進入有機相,也可能干擾藥物的分析。采用高氯酸作為蛋白沉淀劑時,其優(yōu)點是殘留在上清液中的ClO4-可加入鉀鹽除去。,3、無機鹽沉淀,一些無機鹽如硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等,能使蛋白質膠體脫水并中和其電荷,使蛋白質失去膠體性質而沉淀下來。無機鹽中以硫酸銨最常用。常用的重金屬鹽類有汞鹽、銅鹽和鋅鹽等,它們能與蛋白質形成不溶鹽而沉淀析出。如可用HgCl2作為蛋白沉淀劑處理血

37、漿樣品,離心后用比色法測定上清液中的水楊酸濃度。采用蛋白沉淀劑,只要加入足量,一般可除去98%以上的蛋白。蛋白沉淀后是否與之相結合的藥物能游離釋出,目前尚缺乏系統(tǒng)的研究資料,僅觀察到少數(shù)現(xiàn)象。,4、透析法,透析法與超濾法也是除去樣品中蛋白的方法。透析法很費時,溶質透過膜的程度與被測物的性質、溫度有關,膜需常常更新,很難自動化,因此透析法一般不用于常規(guī)分析,而用于藥物在生物樣品中蛋白結合率的研究。,5、超濾法,超濾法是另一種除去樣品中

38、蛋白和其他大分子的方法,也是一種薄膜分離技術。與蛋白沉淀法相比,其優(yōu)點是適用于小量樣品,不稀釋試樣,也不改變試樣的pH,尤其適于含對酸堿不穩(wěn)定的化合物的樣品,用于樣品的濃縮、脫鹽、不同分子尺寸的分離。如果待測物易被某種酶分解,那么超濾除去該酶后就避免了待測物的分解。在殘留分析中超濾法常用于牛奶、血液中游離藥物濃度和藥物-血漿蛋白結合率的測定。超濾法的缺點是待測物可能被結合在濾膜上而影響回收率,而且一些能與大分子蛋白結合的藥物也會隨

39、著蛋白質被除去而丟失。,五、冷凍干燥,冷凍干燥是貯存和預處理某些生物樣品的有效方法,適合于處理量大的樣品。例如,一些樣品中所含藥物水溶性很強(不容易被有機溶劑萃取),可凍干后再進行液-固萃取。凍干法也適用于一些含揮發(fā)性藥物的樣品以及對熱不穩(wěn)定的樣品。此外,還有一些生物樣品中的藥物需進行衍生化,若采用常規(guī)的液-液萃取,在一定溫度下?lián)]發(fā)去有機溶劑后再進行衍生化,則在加熱過程中會導致藥物分解或隨溶劑一起揮發(fā),因此也宜將這些樣品經(jīng)凍干處理

40、后再行衍生化。,,生物樣品凍干時,可先將其置干冰-丙酮浴中、液氮中或其他低溫條件下,半固體樣品如糞便、組織等冷凍時間約1~10min。冷凍后水分在樣品表面形成“冰殼”,增加了揮發(fā)面積,再將其放入凍干機內減壓,冰則直接升華,和其他揮發(fā)性雜質一起被除去,使樣品干燥。凍干后的樣品通?？芍苯蛹尤胗袡C溶劑萃取。凍干時應注意某些揮發(fā)性強的藥物可能揮發(fā)損失。,操作步驟,六、結合物水解,以結合狀態(tài)存在的藥物大多存在于尿中,但也存在于肝臟和血液中。常

41、用的結合物水解的方法有:(1)酸水解酸水解通常使用無機酸,如尿樣中結合物水解可加入適量的鹽酸液。加入鹽酸的濃度、酸化時間以及是否需要加熱等,隨藥物而異,但最終應通過實驗確定。水解后的樣品呈強酸性,必要時可用堿液調整pH后再進行萃取。,藥物在體內經(jīng)代謝反應之后,形成葡糖苷酸及硫酸酯等結合物,(2)酶水解,酶水解是專一性很強的水解結合物的方法。通常使用的水解酶是β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可專門水解藥物的葡萄糖醛酸苷,后者水

42、解藥物的硫酸酯。也可用兩者的混合物,將生物樣品中藥物的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同時水解。尿液中通常存在以上兩種結合物,因此混合酶水解法具有實用價值。,(3)溶劑解,某些藥物或內源化合物的硫酸酯,可隨加入的萃取溶劑,在萃取過程中發(fā)生分解,通常稱為溶劑解。溶劑解也是分解結合物較溫和的一種方法。,七、樣品提取和凈化,1、液-液萃取液-液萃取是經(jīng)典的提取方法之一,它基于被測組分在不相溶的兩種溶劑中的分配。與其他方法相比,液-液萃取法仍是目

43、前最常用的樣品處理方法,其原因是:①通過萃取可將被測組分自大量內源性物質中分離出來,減少雜質對測定的干擾;②操作簡單快速、經(jīng)濟實用;③可將萃取液蒸發(fā),使組分富集;④可一次進行同類組分的萃取。,提取→凈化→濃縮→色譜分析,液-液萃取的溶劑選擇,液-液萃取常用的有機溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。溶劑選擇應注意以下幾點:①溶劑的極性，根據(jù)相似相溶原理,極性組分易溶于

44、極性溶劑,反之亦然,應根據(jù)被測組分的極性選擇相似極性的溶劑。實際萃取被測組分時,還常于萃取溶劑中加人第二種溶劑,以調整極性,使達到選擇性萃取。,,②溶劑的沸點，萃取分離后的有機相通常需置溫水浴中通壓縮空氣(或氮氣)使揮發(fā),將被測組分濃集,因此萃取溶劑的沸點就不應接近或高于水的沸點,否則揮發(fā)困難。③溶劑的毒性，使用對人體有害的溶劑萃取時,應在通風櫥內進行。在常用溶劑中,乙酸乙酯既安全又無毒,對不同極性的被測組分均有較高的萃取回收率,

45、又易于揮發(fā),萃取物中混入的內源雜質量少,是較理想的首選溶劑。,,④溶劑與水的互溶性有的溶劑如乙醚,萃取后可混入大約1.2%的水分,因此伴隨帶入一些水溶性雜質。乙醚萃取能力強,又易于揮發(fā)濃縮,為常用萃取溶劑,除去混入水分的方法是加入無水Na2SO4脫水,減少混入的水溶性雜質量。萃取時于水相中加入有機相后,一般只萃取一次。特殊情況下(如雜質不易除去),則必須將第一次萃取分出的含藥有機相,再用一定pH的水溶液反萃取,最后再從水相將藥物萃

46、回到有機相中。,萃取溶劑與水的比例,萃取過程中加入的有機溶劑并非越多越好,而應適量。一般有機相與水相容積比以1:1或2:1為佳,據(jù)被測組分的性質及方法需要,有時也增加有機相的比例。另外,萃取時若往水相中加入少量比重大的有機溶劑(如氯仿),而該溶劑對藥物的溶解度又比較大,則可將藥物從水相中濃集于小體積的有機相中,若萃取時使用的是尖底試管,則富含藥物的有機相沉積于管尖部位,可直接取樣分析,或將其分離出來。,離子對試劑,一些酸性或堿性較強

47、的有機藥物在體液中呈離解狀態(tài),成為親水性極強的帶電荷離子,即使控制pH也不能抑制它們的電離,不能用有機溶劑將其自體液中提取出來。對于上述呈離解狀態(tài)的藥物,可加入離子對試劑,使它們形成具有一定脂溶性的離子對絡合物,用有機溶劑將其從水相中萃取出來。陽離子藥物配對的離子對試劑則為陰離子,其中以烷基磺酸鹽類(RSO3H)為最常用。,,陰離子藥物配對的離子對試劑主要為烷基季銨類化合物,可用通式R4N+· X-表示,X-可為酸根或氫氧

48、基,R為烷基。烷基碳鏈長度常用C4~C12,甚至可選用C20,碳鏈越長，則生成的離子對絡合物脂溶性越高。常用的烷基季銨中有四丁基銨、四戊基銨等,商品試劑常用其鹽,如磷酸四丁基銨、硫酸氫四丁基銨,或為其氫氧化堿,如氫氧化四丁基銨。,注意事項：,液-液提取有時會發(fā)生乳化現(xiàn)象以及被測組分損失。為了防止乳化,可應用較大體積的有機溶劑,避免猛烈振搖或加入適當?shù)脑噭└淖兤浔砻鎻埩Χ迫?若已發(fā)生嚴重的乳化現(xiàn)象,可將試管置于冰箱中冷凍破乳。萃取

49、過程中所用的玻璃容器壁對某些藥物的吸附是不可忽略的,特別是當藥物濃度較低時更是如此。除對萃取所用的器具進行硅烷化處理以外,還常在萃取劑中加入異戊醇。異戊醇能減少玻璃壁的吸附,還可減少萃取過程中乳化的形成。也可以加入二乙胺,二乙胺能顯著減少吸附作用,提高萃取回收率。,2、固相萃取(SPE),固相萃取法(Solid phase extraction,SPE)是近十幾年迅速發(fā)展起來的一種樣品預處理技術,它是以液相色譜分離機制為基礎建立起來的分

50、離和純化方法。固相分離有兩種實現(xiàn)樣品純化的途徑。一種是保留雜質,待測組分不被保留而自然流出或者被洗脫;更為常用的一種途徑是先使待測物完全保留在柱上,使干擾雜質隨樣品溶劑或洗滌液洗出,然后以小體積溶劑洗脫待測物。,優(yōu)點：,與經(jīng)典的液-液萃取法相比,固相萃取的優(yōu)點有:①快速,一般l~2min即可完成;②回收率高,通常超過90%;③精密度比較好;④樣品用量少,有一定的選擇性,無乳化現(xiàn)象等。,SPE柱,SPE柱可以是一個玻璃(或塑料)

51、小柱,裝入適當?shù)奶盍?固相提取劑),自制的固相萃取柱填充疏松,溶劑能自然流出。現(xiàn)在已經(jīng)有許多不同形式的商品化固相萃取柱,大多數(shù)商品化柱都是聚丙烯管型柱,底部壓縮裝入100~500mg的填料。使用時將液體樣品從柱上口加入,樣液通過固相萃取柱下端流出,液體樣品通過柱子時必須施加外力,可在柱下端出口處減壓,或于柱上口加壓,使樣液通過柱床,柱下端流出液可用另一支試管收集。,固相萃取裝置和操作過程,,SPE采用的固定相與液相色譜常用的固定相類

52、型相同,常用的固定相有活性炭、硅膠、氧化鋁等吸附劑、高分子大孔樹脂、離子交換樹脂和鍵合硅膠等。鍵合硅膠固相提取的一般操作步驟如下:① 以適當強溶劑濕潤固相萃取柱使其溶劑化;②以弱溶劑通常是水或緩沖溶液洗滌固定相,使其達到良好的分離狀態(tài);③將溶于弱溶劑常是緩沖溶液中的樣品加到固相提取柱上;④以強度適當?shù)娜跞軇?如含有少量甲醇的水或緩沖溶液洗滌、除去基質或干擾組分;⑤用強度較高的溶劑洗脫待測組分,收集洗脫液,直接或適當濃縮后進行

53、色譜分析。,選擇SPE柱,選擇SPE固定相時,主要依據(jù)兩個因素:需要提取的溶質和樣品溶劑。（1）溶質的極性：分析物的極性與固定相極性非常相似時得到分析物的最佳保留。兩者極性越相似保留越好以要盡量選擇極性相似的固定相。例如萃取碳氫化合物（非極性）要采用反相柱（非極性）。 當分析物極性適中時、反相固定相都可使用。,（2）溶劑強度,固定相選擇還受樣品溶劑強度的制約。樣品溶劑強度相對該固定相應該較弱溶劑會增強分析物在吸附劑上的保留。如

54、果溶劑太強得不到保留或保留很弱。舉例：樣品的溶劑是正己烷時，反相柱就不合適，因為正己烷是強溶劑，分析物不會有保留；當樣品溶劑是水時，可以用反相柱，因為水是弱溶劑，不影響分析物的保留。,（3）其他因素,其他還應該考慮以下幾點：①分析物在極性或非極性溶劑中的溶解度；②分析物有無可能離子化，從而決定可否用離子交換固定相；③分析物有無可能與固定相形成共價鍵；④不要的組分與分析物在固定相結合點上的競爭程度。,3、基質固相分散技術（MSP

55、D）,基本操作：將樣品 (固態(tài)或液態(tài))直接與適量反相鍵合硅膠一起混合研磨，使樣品均勻分散于固定相顆粒的表面，制成半固態(tài)裝柱，然后后采用類似于SPE的操作進行洗脫。所用的填充料一般為C18或C8，樣品和填充料的比例通常為1:4。,,MSPD是一種在SPE的基礎上改進后的樣品處理方法，相對于SPE法，它的優(yōu)點在于：依靠機械剪切力、C18鍵合相的去垢效應和巨大的表面積，使樣品結構破碎并且在填料表面均勻分散，濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理中所需的

56、樣品勻化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程，避免了樣品勻化、轉溶、乳化、濃縮造成的待測物損失，而且固定相處理樣品的比容量大，提取凈化的效率較高。MSPD處理樣品耗時短、節(jié)省溶劑、樣品用量少，該方法已被用于近40種的獸藥殘留分析。,4、柱切換技術,柱切換技術是色譜分析中處理復雜樣品的方法之一。利用切換閥改變不同的色譜系統(tǒng)，達到在線樣品凈化、組分富集等目的。此法常用一種長3~5cm，填以粒徑25~40µm填料（類型取決于待測物的

57、保留能力）的預柱，通過切換閥與分析柱連接。進樣后流動相Ⅰ攜帶樣品進入色譜柱，被測組分保留于預柱上，而雜質則隨流動相Ⅰ作為廢液 流出。然后按預先設定的程序改變切換閥的流路，將流動相Ⅱ引入預柱中，流動相Ⅱ洗脫出的被測組分隨即進入分析柱，經(jīng)分離后進入檢測器檢測。,柱切換法的優(yōu)點,①操作簡單，全自動化，含蛋白樣品可直接進樣或簡單地沉淀蛋白離心后即可進樣；②分析結果精密度高，一般無需內標，進樣體積一般為0.2~1.0mL（血漿、血清因黏度較大

58、，需稀釋后進樣），在線處理全過程由計算機程序控制，每個樣品在同一預柱的相同條件下處理，分析結果的RSD一般小于5%。③適于不穩(wěn)定樣品，如易光解、熱不穩(wěn)定樣品的分析，全部過程在封閉狀態(tài)下進行，避免了分離、濃縮等操作；④富集作用，提高了檢測靈敏度，尤其是極性較大的組分，無法用液-液萃取時，柱切換技術特別奏效。,5、超臨界流體萃?。⊿FE）,超臨界流體萃取是一種較新的樣品預處理技術，以超臨界流體（常用二氧化碳）作為提取溶劑。超臨界流體的

59、性質如密度、粘度和擴散性等處于氣體和液體之間，而且與溫度、壓力和流體組成有關。密度越高,其性質越接近液體;密度越低,其性質越接近氣體。超臨界流體既能溶解各種氣體不溶解的物質,又有氣體黏度小、滲透力強等優(yōu)點,可以快速、高效地將被測物從樣品中萃取出來。,超臨界二氧化碳萃取流程圖,二氧化碳液體由高壓泵輸入處于恒溫的預熱管中轉化為超臨界流體并進入樣品管進行萃取。萃取物隨流體通過限流管降溫后進入有少量填料的吸收管內,最后被收集瓶收集。超臨界

60、流體萃取過程大致可分為下面三步:①待測物質從樣品基質中釋放出來并擴散、溶解進入超臨界流體中；②待測物質從萃取器轉移至收集系統(tǒng)；③降低超臨界流體的壓力，有效地收集被萃取的待測物。,,對于極性較大或者離子型化合物,可選擇氨等萃取劑。壓力的變化可以改變超臨界流體對物質的溶解度,因此采用程序升壓就可以把溶解度從大到小的物質先后從樣品中分離出來。根據(jù)被萃取物溶解度的大小,可以采用動態(tài)、循環(huán)和靜態(tài)不同的操作方法。動態(tài)法是讓流體一次通過樣

61、品,這種方法適合溶解度較大的樣品。靜態(tài)法是將樣品在流體中浸泡一段時間后,再使被萃取物從樣品中分離出來。循環(huán)法是讓一定量的流體循環(huán)多次通過樣品,循環(huán)法既可以萃取難溶物質同時又比靜態(tài)法萃取速度快。,6、固相微萃?。⊿PME）,固相微萃取的原理與SPE不同，是建立在待測物在固定相和水相之間達成平衡分配的基礎上。其樣品的前處理和操作也有很大的差異。固相微萃取采用熔融石英光導纖維為固相吸附劑,將其浸泡在樣品溶液中時,樣品中的有機物被吸附在光

62、導纖維的表面。吸附平衡后通過加熱可使被吸附的物質解吸,被解吸的物質可隨著載氣流入氣相色譜儀進行分離測定。,,光導纖維是裝在類似于微量注射器的固相微萃取的針頭內,針頭起著導向和保護光導纖維不被折斷的作用。萃取時將針頭浸入被萃取液中,吸附平衡后再插入氣相色譜的進樣口。光導纖維的吸附量和原始液的濃度有一定的關系。因此固相微萃取是一種簡便、快速、無溶劑的前處理技術。,,固相微萃取法被廣泛地應用于樣品的分析中。包括固態(tài)(如沉積物、土壤等)、液態(tài)

63、(地下水、地表水、飲用水、廢水)及氣態(tài)(空氣及廢氣)中的鹵代烴(包括鹵代芳烴)、有機氨農藥、多環(huán)芳烴、胺類化合物以及石油類等。已有大量的應用文獻報道。,7、免疫親和色譜IAC,免疫親和色譜(Immµno-afinity chromatograplly, IAC)是以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結合反應為原理的色譜技術,其基本過程為將抗體與惰性基質(如珠狀瓊脂糖、鍵合相硅膠)偶聯(lián)制成固定相,裝柱。當含有待測組分的樣品通過IA

64、C柱時,固定抗體選擇性地結合待測物,其他不被識別的樣本雜質則不受阻礙地流出IAC柱,經(jīng)洗滌除去雜質后將抗原-抗體復合物解離,待測物被洗脫,樣品得到凈化。IAC的最顯著優(yōu)點在于對待測物的高效、高選擇性保留能力,特別適用于復雜樣品痕量組分的凈化與富集。,,,第六章 獸藥殘留檢測技術,第三節(jié) 樣品衍生化技術,一、衍生化,衍生化是將樣品中的待測組分制成衍生物,使其更適合于特定的分析方法。衍生化在色譜分析中的作用歸納起來主要有以下幾點:

65、①提高檢測靈敏度;②改變化合物的色譜性能,改善分離效果;③適合進一步做化合物的結構鑒定;④擴大色譜分析的應用范圍。,(1)柱前衍生化,柱前衍生化是在色譜分離前,預先將樣品制成適當?shù)难苌?然后進行分離和檢測。優(yōu)點：衍生化試劑、反應時間和反應條件的選擇都不受色譜條件的限制,衍生化后的樣品能用各種預處理方法進行純化和濃縮,也不需要附加特殊的儀器設備。缺點：操作比較繁雜費時,容易引起誤差,影響測定的準確度。當衍生化試劑的分子量相對

66、大時,其引入還可能減小組分間由于分子大小差別而產(chǎn)生的色譜保留行為的差別。,(2)柱后衍生化,柱后衍生化是樣品經(jīng)色譜分離后,使衍生化試劑與色譜流出組分在系統(tǒng)內進行反應,然后檢測衍生物。優(yōu)點：操作簡便、重復性好,色譜分離相衍生化連續(xù)自動進行,而且衍生化不影響組分的色譜分離。缺點：需要附加輸液泵、混合室和反應器等裝置,由于柱出口至檢測器間有較長的流程,可能發(fā)生色譜峰展寬。,實現(xiàn)柱后衍生化必須滿足下列條件:,①衍生化試劑足夠穩(wěn)定,對檢測器的

67、響應可以忽略,不產(chǎn)生干擾;②衍生化試劑溶液與色譜流動相能互相混溶,混合后不產(chǎn)生沉淀或分層,而且色譜流動相適宜作衍生化反應的介質;③衍生化試劑與色譜柱流出液的速度要匹配,混合迅速且均勻,以免產(chǎn)生噪聲;④衍生化反應必須迅速和重現(xiàn)性好,反應器設計要合理,以盡可能減少峰展寬。,二、HPLC柱后衍生化,(1)柱后衍生化裝置柱后衍生化使色譜柱至檢測器之間增加了混合器與反應器及多個連接部件,這些都將產(chǎn)生柱外效應,導致峰展寬。連接部件產(chǎn)生的峰

68、展寬決定于所用的材料、長度和內徑,需要仔細選擇。高效率混合器管式反應器：螺旋型、編織型,,(2)固相衍生化,將固體微粒(硅膠或高分子微球)填充于內徑5~6mm、長度25~30cm的柱子內就是一個固相衍生化器。固體微粒的表面通常經(jīng)過處理連接有反應基團,叫作固相反應劑。固相反應劑的種類很多,包括氧化型、還原型、基團轉移型和催化劑型,可適應各種衍生化反應的需要。樣品通過時與反應劑發(fā)生衍生化反應,這是一種非均勻體系的反應。大分子只能