丁草胺-鎘復(fù)合污染對土壤微生物的分子生態(tài)毒理效應(yīng)與生物修復(fù)研究.pdf

1、土壤中農(nóng)藥和重金屬是經(jīng)常共存且廣泛分布的典型土壤環(huán)境污染物。開展農(nóng)藥-重金屬復(fù)合污染研究，對于正確評價土壤環(huán)境中復(fù)合污染條件下污染物質(zhì)的遷移轉(zhuǎn)化行為，幫助人們采取合理的整治措施，解決土壤的環(huán)境污染問題具有十分重要的理論和實踐意義。本文以除草劑丁草胺和鎘為典型的有機物和重金屬污染物，在室內(nèi)模擬條件下，開展了丁草胺-鎘復(fù)合污染對兩種土壤(黑土和水稻土)微生物分子生態(tài)毒理效應(yīng)及生物修復(fù)研究。主要研究結(jié)果如下： 1、以丁草胺、鎘為目標(biāo)

2、污染物，通過室內(nèi)模擬試驗，研究了丁草胺-鎘復(fù)合污染對土壤脲酶、磷酸酶和呼吸強度的影響。結(jié)果表明，丁草胺-鎘復(fù)合污染對土壤酶活性的抑制和土壤呼吸作用的影響高于丁草胺和鎘單一處理，復(fù)合污染對土壤酶的抑制作用更明顯。復(fù)合污染的交互作用隨著丁草胺和鎘濃度比例的不同和處理時間的不同分別會產(chǎn)生拮抗作用和協(xié)同作用；其中，丁草胺(100mg/L)+鎘(10mg/L)處理在整個處理過程為協(xié)同作用，而丁草胺(10mg/L)+鎘(10mg/L)和丁草胺(50

3、mg/L)+鎘(10mg/L)處理初期為拮抗作用，在處理的后期則為協(xié)同作用。 2、運用RAPD分子指紋技術(shù)，對丁草胺和鎘單一處理及丁草胺-鎘復(fù)合污染處理對土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的影響進行了初步研究。采用酶-化學(xué)聯(lián)合原位提取法，提取土壤微生物總DNA并純化，得到產(chǎn)量高而且純度也較高的土壤微生物總DNA。采用10條隨機引物的RAPD實驗結(jié)果表明，丁草胺-鎘復(fù)合污染土壤的RAPD多態(tài)性條帶明顯高于單一污染土壤；復(fù)合污染土壤微生物DNA序

4、列與對照土壤中DNA序列的差異較大。表明丁草胺-鎘復(fù)合污染對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有著明顯的影響。 3、分析比較了丁草胺和鎘對水稻土和黑土微生物的影響，結(jié)果表明在兩種土壤中，丁草胺-鎘復(fù)合污染對土壤微生物的影響有差異：水稻土脲酶、磷酸酶及呼吸強度受抑制的程度比黑土大；抑制程度出現(xiàn)變化的時間，水稻土中比黑土早。同時，復(fù)合污染對土壤微生物的RAPD分析結(jié)果表明，雖然黑土和水稻土中的對照處理擴增出的RAPD多態(tài)性條帶數(shù)比較接近，但是丁草

5、胺和鎘處理的土樣微生物DNA序列的多態(tài)性明顯不同，水稻土的微生物多態(tài)性條帶明顯高于黑土。不同處理土樣增加和缺失的DNA條帶的分子量有明顯差異，并且水稻土中變化的條帶分子量大于黑土。微生物群落結(jié)構(gòu)變化試驗結(jié)果進一步驗證了在研究復(fù)合污染對土壤酶和呼吸作用影響的試驗中黑土比水稻土對丁草胺和鎘的耐受和緩沖作用強于水稻土的結(jié)論。 4、從農(nóng)藥廠排污口附近采集土樣，進行富集馴化和反復(fù)純化，篩選到一株能夠有效降解丁草胺的細菌，在純培養(yǎng)條件下，

6、培養(yǎng)3d，對添加濃度為30mg/L丁草胺的降解率可達90％以上；根據(jù)菌體形狀、菌落形態(tài)以及生理生化反應(yīng)特性初步鑒定降解菌屬于革蘭氏陰性好氧惡臭假單胞菌屬(Pseudomonsaputida)，命名為REl。確定了降解菌REl的生長和對丁草胺降解的最適宜溫度為30℃～35℃，pH值6.0～8.0。REl對鎘有一定的耐受能力，在鎘濃度為1mg/L時降解菌能夠正常生長，對丁草胺的降解率達到50％以上，表明降解菌REl在耐受一定濃度鎘的條件下，

7、仍對丁草胺產(chǎn)生降解作用。 5、對降解菌REl的降解酶進行了研究，根據(jù)降解酶的降解活性結(jié)果確定降解酶既含有組成酶又含有誘導(dǎo)酶，組成酶具有降解丁草胺的活性，而經(jīng)過丁草胺和鎘誘導(dǎo)后產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶增加了該菌的降解活性；酶蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗結(jié)果表明，與對照處理相比，丁草胺單一處理和丁草胺-鎘復(fù)合處理降解菌酶蛋白的含量增加了，但是兩處理之間沒有明顯差異。該結(jié)果進一步驗證了丁草胺單一處理和丁草胺-鎘復(fù)合處理能夠提高降解酶活性

8、是因為降解菌產(chǎn)生了誘導(dǎo)酶，并且兩種處理產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶差異不大。 6、雙向電泳技術(shù)是研究蛋白質(zhì)差異表達的關(guān)鍵技術(shù)，本研究比較了兩種雙向電泳樣品蛋白制備方法，確立了以液氮研磨-TCA/丙酮沉淀為主要技術(shù)的降解菌樣品蛋白質(zhì)的制備方法，得到的蛋白樣品用pH4-7的線性IPG和12.5％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，該法簡便，能夠有效的去除蛋白質(zhì)中干擾雙向電泳的雜質(zhì)，得到了高分辨率的雙向電泳圖譜；而且第二向凝膠電泳(SDS-聚丙烯酰胺

9、)采用普通的垂直板凝膠電泳系統(tǒng)替代成套的EttanDALTsix系統(tǒng)，結(jié)果證明重復(fù)性良好，操作簡便，降低了實驗成本和勞動強度。 7、采用液氮研磨-TCA/丙酮沉淀為主的樣品蛋白質(zhì)制備方法進行雙向電泳，研究降解菌在丁草胺和鎘脅迫的條件下酶蛋白變化的特點。結(jié)果表明，丁草胺和鎘處理的降解菌的蛋白發(fā)生了明顯的變化，其中發(fā)生明顯變化的11個蛋白點中，有10個蛋白為明顯的上調(diào)蛋白，1個蛋白為新發(fā)現(xiàn)的蛋白。通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索對差異蛋白