異養(yǎng)細(xì)菌硫化物氧化途徑及產(chǎn)物分析.pdf

1、硫化物與地球上生命的出現(xiàn)有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，硫化物與酸性含鐵的水相互作用促進(jìn)了膠體性鐵硫蛋白膜的出現(xiàn)，被認(rèn)為大大提高了第一個(gè)有機(jī)物合成事件的頻率。從許多古代化石中可以發(fā)現(xiàn)，有許多化能自養(yǎng)的生物是以硫化合物為基礎(chǔ)能源生活的，直到現(xiàn)在，硫化物繼續(xù)影響著許多生物的生長(zhǎng)，而且硫在微生物生物質(zhì)中是第6大豐富的元素，因此硫和硫化物的代謝對(duì)于地球化學(xué)循環(huán)至關(guān)重要。
　　環(huán)境中H2S主要是由硫酸鹽還原作用，火山作用等產(chǎn)生，在生物體內(nèi)也產(chǎn)生，主要來(lái)

2、源于氨基酸的代謝。由各種方式產(chǎn)生的H2S還可以釋放到環(huán)境中，而且海洋中也會(huì)產(chǎn)生許多含硫化合物，例如氣態(tài)的H2S和SO2等都會(huì)釋放到空氣中。多余的H2S會(huì)污染空氣，SO2會(huì)造成酸雨等眾多環(huán)境質(zhì)量問(wèn)題。一般H2S的去除是氧化到硫酸鹽，之后被植物利用，從而完成硫循環(huán)的關(guān)鍵步驟，而自然界中H2S的氧化主要是靠微生物的作用，尤其是一些硫氧化細(xì)菌和古生菌。
　　H2S的毒性與其濃度密切相關(guān)，在高濃度時(shí)會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生神經(jīng)性的毒性，而在低濃度時(shí)可以

3、起到重要的生理功能，如在哺乳動(dòng)物中，高濃度的H2S會(huì)導(dǎo)致中毒，但低濃度H2S則可以調(diào)節(jié)各種生理功能等，由此H2S被認(rèn)為是繼NO和CO后的第三種氣體信號(hào)分子。
　　維持H2S的濃度對(duì)于生物來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，生物中過(guò)多的H2S主要是通過(guò)酶的聯(lián)合作用發(fā)生氧化而去除的。在哺乳動(dòng)物線(xiàn)粒體中包含了一套重要的酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)由硫醌氧化還原酶(SQR)，過(guò)硫化物雙加氧酶(PDO)和硫轉(zhuǎn)移酶(ST)組成，這3個(gè)酶進(jìn)行聯(lián)合作用，將H2S代謝為硫代硫酸鹽，該

4、系統(tǒng)的代謝路線(xiàn)已經(jīng)被報(bào)道，但對(duì)于H2S的氧化途徑仍存在著一些不清楚的問(wèn)題。這些問(wèn)題主要集中在(1)硫醌氧化還原酶氧化H2S的產(chǎn)物—硫烷硫，具體是什么形式的？在真核生物線(xiàn)粒體中SQR的活性需要有硫烷的受體，是否在所有的生物中都需要？如果需要，受體是什么？現(xiàn)有的報(bào)道認(rèn)為谷胱甘肽，半胱氨酸，亞硫酸鹽都可能作為受體，但真正的生理受體并不清楚;(2)SQR/PDO/ST這套系統(tǒng)在異養(yǎng)細(xì)菌中是否存在？如果存在，其作用是否和真核生物中相似？(3)在異

5、養(yǎng)細(xì)菌中是否存在與真核生物不同的還原性無(wú)機(jī)硫化合物的代謝途徑？其生理意義是什么？(4)在微生物中的研究大多都集中在自養(yǎng)型細(xì)菌中，在異養(yǎng)細(xì)菌中的研究較少，但是由于異養(yǎng)細(xì)菌廣泛的分布、數(shù)量的優(yōu)勢(shì)以及生長(zhǎng)繁殖的快速等優(yōu)勢(shì)，使得它代謝H2S的速率可能更快，這可能具有重要的生態(tài)學(xué)意義。
　　為了解決以上提出的問(wèn)題，本文重點(diǎn)放在異養(yǎng)細(xì)菌H2S的生物氧化上，以大腸桿菌作為載體研究了SQR/PDO/ST系統(tǒng)的酶學(xué)、氧化H2S的能力、途徑以及產(chǎn)物等

6、，或直接在野生菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134中研究代謝H2S的情況。具體研究了以下內(nèi)容;
　　(1)利用已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的過(guò)硫化物雙加氧酶(PDO)基因作為查詢(xún)序列，通過(guò)BLAST程序，在已經(jīng)測(cè)序的細(xì)菌基因組中，尋找是否有存在于細(xì)菌中的過(guò)硫化物雙加氧酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶的同源蛋白質(zhì)廣泛存在于細(xì)菌中，并主要集中在變形菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)，約占已經(jīng)測(cè)序細(xì)菌基因組總量的20％;根據(jù)多序列比對(duì)，將新發(fā)現(xiàn)的與已經(jīng)報(bào)道的蛋

7、白質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，以此將可能的過(guò)硫化物雙加氧酶分為3類(lèi);PDO1，PDO2和Blh，并且這3類(lèi)與GloB1和GloB2的親緣關(guān)系較近，后兩者都是乙二醛酶。已經(jīng)報(bào)道的MxPDO1和PpPDO2的結(jié)構(gòu)解析顯示PDO1和PDO2在底物結(jié)合位點(diǎn)上的區(qū)別，從而說(shuō)明了本文對(duì)于PDO的分類(lèi)的準(zhǔn)確性。從這3類(lèi)PDO以及GloB1和GloB2中共挑取了14個(gè)蛋白質(zhì)，利用GSSH作為底物對(duì)其酶活性進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)酶具有過(guò)硫化物雙加氧酶活性，

8、分別屬于PDO1，PDO2和Blh這三類(lèi)，其中以MxPDO1a催化效率最高，在GloB1和GloB2中選擇的蛋白質(zhì)均沒(méi)有活性，與我們用進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果相吻合。通過(guò)ICP-MS檢測(cè)了CpPDO2等酶的重金屬組成，發(fā)現(xiàn)它含有與蛋白濃度等量的Fe2+，并利用透析實(shí)驗(yàn)和金屬離子孵育的方法進(jìn)一步確認(rèn)了PDO需要Fe2+作為輔因子，一部分PDO中可以用Mn2+取代Fe2+，這與過(guò)硫化物雙加氧酶屬于MBL(metallo-β-lactamase)

9、家族的特征相符合。根據(jù)序列相似性，利用BLASTP程序?qū)ふ伊嗽诟锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌中的可能的硫加氧酶，將這3個(gè)可能的硫加氧酶基因與已知活性的CpSQR的基因連接在一起，并克隆至pBBR1MCS2質(zhì)粒上，再轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)，分析了該菌株的活性，發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)的菌株能夠快速的代謝H2S，說(shuō)明這些陽(yáng)性菌中可能的硫雙加氧酶具有氧化硫烷（由CpSQR代謝H2S產(chǎn)生）的能力，但無(wú)法確定其是否以GSSH作為底物。將PaPDO2在其野生菌

10、株P(guān)seudomonas aeruginosa PAO1敲除后發(fā)現(xiàn)突變株△PaPDO2積累了更多的H2S，這說(shuō)明PDO在細(xì)菌H2S的氧化中起到重要的生理功能。
　　(2)將Cupriavidus pinatubonensis JMP134中的2個(gè)酶，CpSQR和CpPDO2克隆至大腸桿菌中，進(jìn)行異源表達(dá)，研究它們代謝H2S的途徑。由于CpSQR中包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，HcaD和DUF442，其中根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)知道HcaD是一個(gè)硫醌氧

11、化還原酶，而DUF442則是一個(gè)可能的硫轉(zhuǎn)移酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CpSQR代謝H2S的產(chǎn)物主要是二硫化物和三硫化物，這與真核生物中不同;另外，發(fā)現(xiàn)并證明了CpDUF442是一個(gè)具有硫轉(zhuǎn)移酶功能的結(jié)構(gòu)域，它在3個(gè)酶催化H2S的反應(yīng)中起到的作用都與在真核生物中的硫轉(zhuǎn)移酶不同，其中一個(gè)新功能是它促進(jìn)SQR產(chǎn)物多硫化物和GSH的反應(yīng)速度，這暗示著CpDUF442在促進(jìn)硫烷轉(zhuǎn)移速率上發(fā)揮了重要的作用;另外，CpDUF442還催化GSSH和SO32-的反應(yīng)

12、，這與真核生物中報(bào)道的一致。發(fā)現(xiàn)了多硫化物和GSH或亞硫酸鹽可以自發(fā)反應(yīng)，并通過(guò)光譜學(xué)方法計(jì)算了它們的自發(fā)反應(yīng)速率，分別是8.4±0.7μM min-1和6.3±0.5μM min-1，當(dāng)加入CpDUF442時(shí)，前者的反應(yīng)速度增加為13.3±1.2μM min-1，而后者則沒(méi)有明顯變化。生化實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)分析數(shù)據(jù)都表明，CpDUF442不能以硫代硫酸鹽作為底物，這與人和酵母線(xiàn)粒體中硫轉(zhuǎn)移酶能轉(zhuǎn)移硫代硫酸鹽和GSH反應(yīng)生成GSSH和亞硫酸鹽的

13、結(jié)論不一致。本文還對(duì)異源表達(dá)菌株代謝H2S和多硫化物的途徑進(jìn)行了闡述，研究了它們的代謝產(chǎn)物，并利用代謝產(chǎn)物進(jìn)行了流量平衡分析;CpSQR和CpPDO2代謝H2S的產(chǎn)物為亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽的混合物，有少量的硫烷累積，從流量平衡分析來(lái)看，CpDUF442催化GSSH和SO32-的功能在該系統(tǒng)中的作用并不明顯，硫轉(zhuǎn)移酶在代謝H2S過(guò)程中所起的作用可能主要是促進(jìn)硫烷硫的分配，例如多硫化物和GSH的反應(yīng)。最后，根據(jù)流量平衡分析提出了H2S在大腸

14、桿菌中氧化途徑的模型。
　　(3)在Cupriavidus pinatubonensis JMP134中，利用已經(jīng)測(cè)序的基因組數(shù)據(jù)，對(duì)其硫化合物代謝相關(guān)的基因進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)它具有多個(gè)和硫化合物氧化相關(guān)的系統(tǒng)，分別是SQR/PDO/ST系統(tǒng)，SOX系統(tǒng)，SO系統(tǒng)以及FCSD系統(tǒng)等，利用無(wú)痕敲除對(duì)這些系統(tǒng)的關(guān)鍵基因進(jìn)行了單敲除或多敲除，并利用野生菌和敲除菌株的全細(xì)胞分析了代謝H2S，SO32-或S2O32-的產(chǎn)物。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)

15、，負(fù)責(zé)H2S氧化的主要是SQR/PDO/ST系統(tǒng)，SOX系統(tǒng)可能在SQR功能失活后起到互補(bǔ)的功能，也可能是互補(bǔ)SQR的功能，但是效率不高;在野生菌中SQR/PDO/ST系統(tǒng)代謝H2S時(shí)可檢測(cè)到的產(chǎn)物只有S2O32-，這與利用大腸桿菌異源表達(dá)SQR/PDO/ST氧化H2S時(shí)的產(chǎn)物（SO32-和S2O32-的混合物）不同，分析與PDO的活性有關(guān)系，代謝產(chǎn)物是否具有SO32-仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn);負(fù)責(zé)外源的SO32-氧化的主要是SO系統(tǒng)，即Sor

16、AB，產(chǎn)物為硫酸鹽，并且亞硫酸鹽消耗和硫酸鹽生成接近1∶1，SOX系統(tǒng)（包括SoxCD）并不能起到氧化外源亞硫酸鹽的作用;同樣，負(fù)責(zé)內(nèi)源和外源S2O32-氧化的系統(tǒng)主要是SOX系統(tǒng)，氧化產(chǎn)物為硫酸鹽，每分子硫代硫酸鹽生成約2分子硫酸鹽，SoxF（即FCSD）可能作為SOX的一個(gè)重要部分參與其氧化硫代硫酸鹽和H2S，但是單獨(dú)作用并沒(méi)有氧化H2S的功能。亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽的氧化途徑均符合質(zhì)量守恒定律，這樣在細(xì)胞中不會(huì)過(guò)多地積累這一類(lèi)硫化合

17、物，均以硫酸鹽的形式排放到環(huán)境中。根據(jù)基因組分析和全細(xì)胞分析的結(jié)果，還提出了在異養(yǎng)細(xì)菌C.pinatubonensis JMP134中的硫化合物的代謝模型，該模型包括了從硫酸鹽的同化作用開(kāi)始，到細(xì)胞內(nèi)H2S的產(chǎn)生，以及H2S主要由SQR/PDO/ST系統(tǒng)氧化的過(guò)程，產(chǎn)物可能主要是S2O32-，以及S2O32-與SO32-在周質(zhì)空間內(nèi)依賴(lài)于SOX或SO系統(tǒng)的氧化情況等，還對(duì)于胞內(nèi)的S2O32-與SO32-之間的轉(zhuǎn)化及其與硫烷庫(kù)和硫轉(zhuǎn)移酶的