海洋細(xì)菌pseudomonassp.qdaalgl、algg基因的研究

1、特鲞呼U D c研究生學(xué)位論文海洋細(xì)菌P s e u d o m o n a s s p ．Q D A臼弛、螂基因的研究蹴一蹴名 掛童一姿——荊刪姓名壬立功教授e ¨舯惴剮 砸±々q 愧．蘭一煎堂論文籜辯I j 輯2 壘鰻圭壁且曼一且一學(xué)慨授f 日啊2 9 盟生§且中國(guó)海洋大學(xué)問(wèn)題。本文建立了一種簡(jiǎn)便快捷的甘露糖醛酸c _ 5 差向異構(gòu)酶活性的測(cè)定方法。我們發(fā)現(xiàn)相同分子量的聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸與苯酚硫

2、酸試劑反應(yīng)后顯色程度不同。利用苯酚硫酸法測(cè)定了已知結(jié)構(gòu)的褐藻膠片斷的M ／G 比，其結(jié)果與傳統(tǒng)的1 H - N F f f l 測(cè)定值基本一致。因此，根據(jù)甘露糖醛酸爭(zhēng)5 差向異構(gòu)酶作用前后褐藻膠片段的吸光值差異可以計(jì)算甘露糖醛酸c 一5 差向異構(gòu)酶的活性。此方法簡(jiǎn)便有效，特別是對(duì)于大規(guī)模的產(chǎn)酶菌株篩選、酶促反應(yīng)的條件優(yōu)化等實(shí)驗(yàn)是十分適用的。在褐藻膠的生物合成過(guò)程中，甘露糖醛酸c _ 5 差向異構(gòu)酶決定了褐藻膠的M ／G 比，面不同M ／

3、G 比的褐藻膠具有不同的生物活性。因此，甘露糖醛酸C - 5 差向異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)和功能的研究有著重要的意義，近年來(lái)已成為本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。通過(guò)基因工程技術(shù)改造褐藻膠生產(chǎn)菌株的生物合成途徑，或者直接利用重組酶，就可獲得不同M ／G 比的褐藻膠。本文克隆了P s e u d o m o n a s s p ．Q D A 的甘露糖醛酸c - 5 差向異構(gòu)酶基因a l g G , 構(gòu)建了重組表達(dá)載體p E T 2 4 a - a l g G ，并轉(zhuǎn)

4、化宿主Ec o i lB L 2 1 ，構(gòu)建了生產(chǎn)該酶的工程菌。優(yōu)化后的最佳產(chǎn)酶條件是誘導(dǎo)劑I P T G 終濃度0 ．6 訓(xùn)，誘導(dǎo)溫度為2 5 “ C ，誘導(dǎo)時(shí)間為1 6 小時(shí)．粗酶液的活性分析結(jié)果表明以多聚甘露糖醛酸或褐藻膠為底物該酶具有較高的活性。在3 0 ℃，反應(yīng)1 8 小時(shí)的條件下，可將底物終濃度為I m g ／m L 的聚甘露糖醛酸3 3 9 6 轉(zhuǎn)變?yōu)楣帕_糖醛酸。目前，酶的分離純化和性質(zhì)分析正在進(jìn)行。關(guān)鍵詞：褐藻膠裂解酶甘