gfp葉綠體轉(zhuǎn)化煙草莖葉降解對土壤微生物數(shù)量及土壤酶活性的影響

1、農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào) 2 0 11 ． , 3 0 ( 3 ) ． 5 0 8 一 - 5 1 2J o u r n a lo fAg r o — En v i r o n me n tS c i e n c e葉綠體轉(zhuǎn)化煙草莖葉降解對土壤 微 生物數(shù) 量 及 土壤 酶 活 性 的影 響 余建平 ，呂月萍 ， 劉佳莉 ， 劉慶 國， 郭長虹 ( 哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 ， 分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 哈爾濱 1

2、5 0 0 2 5 )摘 要 ： 以 G F P葉綠 體轉(zhuǎn)基 因煙草及對照煙 草( 非轉(zhuǎn)基 因煙草 ) 為材料 ， 在實(shí) 驗(yàn)室條件 下研究 了葉綠體 轉(zhuǎn)基 因煙草及 對照煙 草 ( 非轉(zhuǎn)基 因煙草 ) 在莖葉降解過程 中及完全降解后對土壤微生物主要類群 ( 細(xì)菌 、 真菌 、 放線 菌 ) 的影響 ， 并對相關(guān)的土壤酶活性進(jìn) 行了分析 。結(jié)果表 明， 在煙草莖葉降解過程中及完全降解后 ： ( 1 ) 葉綠體轉(zhuǎn)基 因煙草及對照炯草( 非轉(zhuǎn)

3、基 因煙草 ) 對微生物 的數(shù)量影 響不顯著 ； ( 2 ) 土壤微生物總量相 比為細(xì)菌> 放線菌> 真菌 ； ( 3 ) 葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草莖葉降解對土壤酶活性沒有顯著影 響 ； ( 4 ) G F P 基 因沒有水平轉(zhuǎn)移到土壤微生物基因組 中。 以上結(jié)果顯示 G， 葉綠體轉(zhuǎn)化煙草莖 葉降解對土壤微生物數(shù)量及土壤酶活性沒有顯著的 影 響。關(guān)鍵詞 ： 葉綠體轉(zhuǎn)化煙草 ； 根 際微生物 ； 莖葉降解 ； G F P 基因 ； 土

4、壤酶 中圖分類號(hào) ： X 5 3文獻(xiàn)標(biāo)志碼 ： A文章編號(hào) ： 1 6 7 2 一 - 2 0 4 3 ( 2 0 1 1 ) 0 3 一 - 0 5 0 8 — 0 5Efe c t so ft h eS t e m a n dLe a fDe c o mp o s i t i o no fGF PT r a n s p l a s t o m i cTo b a c c oo nM i c r o o r g a n i s m

5、 P o p u l a t i o n sa n dEn z y me sAc t i v f l t yi nS o i lY UJ i a n - p i n g ， L VY u e - p i n g , ． L I UJ i a - l i ， L I UQ i n g — g u o ， G U OC h a n g — h o n g “( K e yL a b o r a t o r yo fM o l e c u

6、 l a rC y t o g e n e t i e sa n dG e n e t i cB r e e d i n go fH e i l o n g , j i a n gP r o v i n c e ， C o l l e g eo fL i f eS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y ， H a r b i nN o r m a lU n i v e r s i t y ， H a r

7、 b i n1 5 0 0 2 5 ， C h i n a )A b s t r a c t ： T h ed e v e l o p me n ta n du s eo fg e n e t i c a l l ym o d i f i e dCa n ts ( G MP s )h a v eb e e nat o p i co fc o n s i d e r a b l ep u b l i cd e b a t ei nr e

8、c e n ty e a r s ． An dt h e r ea r ema n ys t u d i e sa d d r e s s i n gp o t e n t i a lr i s k so fGMPc u l t i v a t i o n ，mo s to fwh i c hh a v ea d d r e s s e do n l ya b o v e g r o u n de f e c t s , ．Ho we

9、v e r ． ， t h e r ea r ef e ws t u d i e st h a te v a l u a t et h ee f f e c t so ft h er e s i d u ed e c o mp o s i t i o no ft r a n s p l a s t o mi ct o b a c c oo nmi c r o o r g a n i s m p o p u l a t i o n sa

10、 n de n z y m e sa c t i v i t yi ns o i l ． T os t u d yt h ee f l e e to ft h et r a n s p la s m m i ct o b a c c or e s i d u eo nt h es o i le c o l o g i c a le n v i r o n me n t , ， t h ec o m mu n i t i e so fb

11、a c t e r i a ． f u n g ia n da c t i n o my c e t e sa n ds o i le n z y mea c t i v i t i e sw e r ei n v e s t i g a t e db e t w e e nt h eGt r a n s p l a s t omi ct o b a c c op l a n t sa n dt h ec o n —t r o i s

12、( n o n — g e n e t i c a l l ym o d i f i e dt o b a c c o ) d u r i n ga n da f t e rt h e i rs t e m sa n dl e a v e sc o m p l e t ed e c o m p o s i t i o n ． T h er e s u l t ss h o w e d ： ( 1 ) T h ee f e c to ft

13、 r a n s p l a s t o mi ct o b a c c oa n dc o n t r o lt o b a c c ot om a j o rmi c r o b i a lg r o u p si na mo u n tw a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t． ( 2 ) N om a t t e rt r a n s p la s t p m i

14、ct o b a c c oo rc o n t r o l s ． ， t h em i c r o b i a ln u m b e rw a sb a c t e r i a > a c f i n o m y c e t e > f u n g i ． ( 3 ) S o i le n z y mea c t i v i t i e sw e r en o ta f f e c t e db ys t e ma n

15、dl e a fd e -c o mp o s i t i o no fG F Pt r a n s p l a s t o mi ct o b a c c o ． ( 4) NoGg e n eh a dt r a n s f e r r e dt os o i lmi c r o b i a 1 ． T h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a td e c o mp o s i t i

16、o no f cF Pt r a n s p l a s t o mi ct o b a c c or e s i d u eh a dn od i s t i n c te f f e c to nmi c r o o r g a n i s mp o p u l a t i o n sa n de n z y me sa c t i v i t yi ns o i l ．Ke y wo r d s ： t r a n s p l a

17、 s t p mi ct o b a c c o ； r h i z o s p h e r emi c r o b i a l ； s t e m a n dl e a fd e c o mp o s i t i o n ； Gg e n e ； s o i le n z y me s自 1 9 8 3年首 次獲得 轉(zhuǎn)基 因馬鈴薯 、 煙 草 以來 ， 轉(zhuǎn) 基 因技術(shù) 在農(nóng)業(yè) 生產(chǎn) 中得 到 了越 來越 廣泛 的應(yīng) 用 。 將 外

18、源 目的基 因?qū)?葉綠 體 基 因組 的技 術(shù) 已發(fā) 展成 為 收稿 日 期 ： 2 0 1 0 - - - 0 9 — 0 4基金項(xiàng) 目： 國家 自 然科學(xué)基金( 3 0 9 7 0 5 5 2 )作者簡 介： 余建平( 1 9 8 5 一 ) ， 女 ， 吉林 四平人 ， 碩士研究生 ， 主要從事 葉 綠體轉(zhuǎn)化煙草對土壤環(huán)境影響 的研究。E — ma i l ： y u j i a n p i n g 2 0 0 3 @16 3

19、． C O I l l通 訊 作 者 ： 郭 長 虹 E — m a i l ： k a k u 3 0 0 8 @y ~ a h O O ． c o n． C l l植物基 因工程 的新生長點(diǎn)。與常規(guī)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)化相 比， 葉綠體轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)在于 ： 葉綠體中以多拷貝形式 存在 的外源 基 因可實(shí)現(xiàn) 高水平 表 達(dá) ， 通 常 比細(xì)胞核 轉(zhuǎn) 化的表達(dá)量高出幾十倍 ， 甚至幾百倍 捌 。通過葉綠體 轉(zhuǎn)化還可使外源基因定點(diǎn)整合在基因間隔區(qū)，

20、 不至于 破壞植物的正常基 因功能 ， 從而消除了隨機(jī)整合所造 成的不利影響_ 3 l 。 由于葉綠體的母 系遺傳特點(diǎn) ， 花粉中幾乎不存在外源基因， 轉(zhuǎn)基因植物的安全性將會(huì)提高 51 0余建平等 ： G F P葉綠體轉(zhuǎn)化煙草莖 葉降解對土壤微生物數(shù)量及土壤酶活性的影 響2 0 11 年 3 月變化趨勢相似 ， T G與 WT 莖葉降解對細(xì)菌 、放線菌 、真菌數(shù)量的影響差異不顯著 。 說 明葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草 莖 葉在降解過程中及完全降解

21、后沒有向土壤環(huán)境 中釋放 有害 物質(zhì) ， 影 響 土壤 微 生物 的數(shù) 量 ， 或 是 釋放 的 物質(zhì)量很小不足以顯著影響微生物的數(shù)量 。1 8 0d 時(shí) 微生物數(shù)量高于 1 5 0d ，說明莖葉降解促進(jìn) 了土壤微 生物 的生長繁殖 。土壤微生物總數(shù)都 是細(xì)菌> 放線 菌> 真菌。2 ． 2 莖葉降解 對土壤 酶活性 的影 響 對土 壤脲 酶 、 纖 維 素酶 活性 進(jìn) 行 了分 析 ( 圖 3和 圖 4 ) 。 隨著掩埋天

22、數(shù)的增加 ， 脲酶和纖維素酶的潘陛 都有所增加。脲酶能促進(jìn)肽鍵的水解 ， 其活性與土壤 微生物的數(shù)量 、有機(jī)質(zhì)的含量和速效氮呈正相關(guān) ， 可 以表示土壤的氮素供應(yīng)狀況 ， 葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草土壤 脲酶活性 比對照組略低 ，說明對照組氮素供應(yīng)多一 些 ； 土壤纖維素酶活性 比非轉(zhuǎn)基因煙草的低 ， 說 明葉 綠體轉(zhuǎn)基因煙草完全降解后在一定程度上降低 了土 壤纖維素酶活性 ， 但二者活性無顯著差異 ， 說 明葉綠 取樣 天數(shù) S a m p l

23、 i n gd a y s ／ d圖 3葉綠體轉(zhuǎn)化煙草莖葉降解對土壤脲酶活性的影響 F i g u r e3Ef e c t so ft h es t e ma n dl e a fd e c o mp o s i t i o no ft r a n s p l a s t o mi ct o b a c c oo nu r e a s ea c t i v i t yi ns o i l： ：專 o ．0O．體轉(zhuǎn)基 因煙草對土壤 的脲

24、酶和纖維素酶活性的影響 不大 。2 ． 3 土壤 D N A的 GF P基 因擴(kuò)增 試劑盒提取的 D N A主帶較亮 ， 無彌散現(xiàn)象 ， 說明 所提取的 D N A較為完整 ， 無明顯降解。 用基因特異引 物進(jìn)行 P C R擴(kuò)增 ，在陽性對照質(zhì)粒中擴(kuò)增 出了 G F P基 因的產(chǎn)物 ，而在野生型煙草 和轉(zhuǎn)基 因煙草的土壤 D N A樣品中沒 有檢測到 G F P基因序列 ( 圖 5 ) ， 說 明G F P 基因在土壤 中沒有殘 留，

25、沒有通過水平轉(zhuǎn)移到微 生物 基 因組 中。5 0 0b pM： A ／ H i n dI I Im a r k e r ； w T： 野生型煙草 ； T G 1 ～ T G 4 ： G F P葉綠體轉(zhuǎn)化 煙草 ； P ： 陽性質(zhì)粒 M： A ／ H i n dI I Im a r k e r ； WT ： w i l dt y p et o b a c o o ； T G l— T G 4 ： G F Pt r a n s p l a

26、s t o mi ct o b a c c o；P： p o s i t i v ec o n t r o l圖 5土壤 D N A的 G F P基因擴(kuò)增結(jié)果( 1 8 0d )F i g u r e5T h eP C R a mp l i i f i c a t i o nr e s u h so fs o i lDNAw i t hG F P p r i me r s ( 1 8 0d a y s )3 討 論 土壤微生物是土壤生

27、態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。 因此 ，評價(jià)轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響意義重大。Y u d i n a 等的研究表 明， 4 種不 同轉(zhuǎn) B t 基 因棉花促使 土壤 中細(xì) 菌和真菌數(shù)量發(fā)生 短暫性 的顯 著增加[ 9 J 。D u n f i e l d 和 G e r n u d a 研究 了在加拿大的 4 個(gè)不 同田塊 連續(xù) 2年種植 4 種轉(zhuǎn)抗除草劑基 因的油菜和 4種常 規(guī) 油菜 品種 對根 際微 生 物多樣 性 的影 響I0 l

28、， 結(jié)果 表 明 轉(zhuǎn)基因油菜品種細(xì)菌群落與常規(guī)品種有差異 ， 轉(zhuǎn)基因油菜的根際微生物群落在一些脂肪酸上顯著偏高， 表 明其微生物群落組成發(fā)生了變化。 沈法富等在大 田栽 培條件下 ，連續(xù) 2 年測定棉花不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn) B t 基 因抗蟲棉和對照品種對土壤微生物的影響『 I 】 1 ， 轉(zhuǎn)基因 抗蟲棉根際微生物和細(xì)菌生理群的數(shù)量發(fā)生了變化 ，且根際細(xì)菌生理群分布的均勻度下降 。 李本金等的研 O5O505D如加oP ．_ 皇 ． ( n