高強(qiáng)度聚焦超聲輻照活體兔眼角膜后對(duì)視網(wǎng)膜及視神經(jīng)的影響.pdf

1、目的：高強(qiáng)度聚焦超聲（High Intensity Focused Ultrasound, HIFU）作為一種新興的體外無(wú)創(chuàng)治療技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于婦產(chǎn)科、肝膽外科、泌尿外科等各個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是臨床實(shí)體腫瘤的治療。20世紀(jì)80-90年代的臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度聚焦超聲在眼科領(lǐng)域中可以用于治療青光眼疾病，然而其運(yùn)用于眼科治療相關(guān)疾病是否具有安全性罕見(jiàn)報(bào)道。本課題組早期研究中已證實(shí)HIFU可以通過(guò)改變活體兔眼角膜的屈光狀態(tài)以矯正老視，因而本

2、研究探討高強(qiáng)度聚焦超聲輻照活體兔眼角膜后對(duì)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的影響，為HIFU應(yīng)用于活體角膜臨床治療的安全性提供理論支持。
　　方法：1.HIFU輻照活體兔眼角膜動(dòng)物模型的構(gòu)建：設(shè)置CZF型超聲治療儀治療參數(shù)為功率1w、頻率10.20MHz、脈沖1000Hz、焦距4.5mm、輻照時(shí)間6S（電動(dòng)機(jī)以10r/min速度帶動(dòng)超聲波治療頭勻速旋轉(zhuǎn)1周所需時(shí)間）、輻照環(huán)直徑約9mm、輻照方式以圓環(huán)狀聚焦定位輻照活體兔眼角膜基質(zhì)，制作角膜焦域環(huán)。

3、選取7只健康成年且眼部無(wú)疾患新西蘭大白兔，每只實(shí)驗(yàn)兔右眼標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組，左眼標(biāo)記為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組用HIFU以圓環(huán)狀定位輻照角膜基質(zhì)，對(duì)照組未行任何處理作為正?？瞻讓?duì)照。于術(shù)畢后1、7、14、30、60、90天行裂隙燈顯微鏡下觀察拍照；隨機(jī)選取5只于術(shù)前、術(shù)畢后1、7、14、30、60、90天行自動(dòng)驗(yàn)光儀測(cè)量術(shù)眼角膜曲率。2.HIFU輻照活體兔眼角膜后對(duì)視網(wǎng)膜的組織形態(tài)學(xué)及生物學(xué)變化觀察：41只健康新西蘭大白兔中隨機(jī)挑取36只（共72眼），

4、將分別于術(shù)畢后1、7、14、30、60、90天隨機(jī)抽取6只（12眼）處死后摘除眼球取材固定，光鏡下觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞層數(shù)和各層細(xì)胞排列情況以及視神經(jīng)組織形態(tài)變化；透射電鏡下觀察術(shù)后視神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；并用免疫組化法檢測(cè)視網(wǎng)膜中勿動(dòng)蛋白（Nogo-A）的活性表達(dá)；原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL）檢測(cè)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞凋亡的情況；檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中超氧化物歧化酶（superoxid

5、e dismutase, SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量。余5只作為OCT組，分別于術(shù)前、術(shù)后1、7、14、30、60、90天行光學(xué)相干斷層掃描儀(Optical Coherence Tomography, OCT)掃描觀察視網(wǎng)膜形態(tài)并測(cè)量視網(wǎng)膜厚度值。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建HIFU輻照活體兔眼角膜動(dòng)物模型。
　　2.裂隙燈觀察結(jié)果：HIFU輻照活體兔眼角膜后即刻角膜輻照范

6、圍上皮出現(xiàn)部分缺損，基質(zhì)層形成灰白色焦域環(huán)，與周邊正常組織分界清楚，熒光素鈉染色可見(jiàn)所對(duì)應(yīng)部位著染，輻照焦域環(huán)于術(shù)后7天逐漸變淡直至消失，熒光素鈉染色為陰性，未見(jiàn)著染，角膜恢復(fù)透明。
　　3.自動(dòng)驗(yàn)光儀測(cè)量結(jié)果：HIFU輻照兔眼角膜術(shù)后1、7、14天角膜平均曲率較術(shù)前稍有增加，其中7天時(shí)增加最為顯著。術(shù)后30、60、90天角膜曲率較術(shù)前有所降低，其中術(shù)后90天角膜曲率稍有增高但曲率值未大于術(shù)前角膜曲率。
　　4.光鏡下視網(wǎng)膜

7、HE染色結(jié)果：對(duì)照組視網(wǎng)膜各層排列規(guī)律整齊，無(wú)散亂排列，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層核清楚分明，視網(wǎng)膜各層間界線清晰厚度正常，間隔較密。輻照后各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)切片HE染色光鏡下觀察結(jié)果較輻照前無(wú)明顯變化。
　　5.光鏡下視神經(jīng)HE染色結(jié)果：對(duì)照組視神經(jīng)橫切面神經(jīng)纖維排列均勻規(guī)整，基質(zhì)淡紅染，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間隔均勻，血管形態(tài)完好。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)組織切片HE染色光鏡下結(jié)果較術(shù)前無(wú)明顯改變。
　　6.電鏡下視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：對(duì)照組視神經(jīng)

8、纖維髓鞘完整、光滑致密，排列規(guī)整，無(wú)脫髓鞘改變。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)較術(shù)前未見(jiàn)明顯變化。
　　7.視網(wǎng)膜免疫組化結(jié)果：正常視網(wǎng)膜中可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)、外顆粒層有少量的Nogo-A陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和外核層均有Nogo-A表達(dá)，與正常對(duì)照組比較表達(dá)未見(jiàn)明顯增強(qiáng)。
　　8.視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（RGCS）未見(jiàn)陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，無(wú)細(xì)胞核皺縮或核碎裂、

9、染色質(zhì)凝集等征象。
　　9.視網(wǎng)膜組織中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量測(cè)定結(jié)果：術(shù)后1天及7天實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組SOD活力均低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組組間相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)組MDA含量均高于并接近于對(duì)照組MDA含量，同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　

10、　10.視網(wǎng)膜光學(xué)相干斷層掃描結(jié)果：OCT組實(shí)驗(yàn)兔結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)均正常，視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，各層結(jié)構(gòu)界線分明、顯像清晰。術(shù)前視網(wǎng)膜厚度均高于術(shù)后各時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜厚度，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的數(shù)據(jù)比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）且不同時(shí)間點(diǎn)組間的數(shù)據(jù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.適當(dāng)劑量的HIFU可準(zhǔn)確定位于角膜基質(zhì)層，對(duì)輻照區(qū)外正常角膜組