趨磁細(xì)菌Magnetospirillum magneticumAMB-1反硝化代謝與DNA損傷修復(fù)體系對(duì)磁小體合成及其遺傳穩(wěn)定性的影響研究.pdf

1、趨磁細(xì)菌是一類能在體內(nèi)合成納米級(jí)磁性礦物顆粒的兼性厭氧型原核生物，在自然界中分布廣泛。趨磁細(xì)菌大部分分布在α，γ，δ變形菌門和硝化螺菌門，其生長(zhǎng)環(huán)境為海水或者淡水的氧化還原交界面處，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的氧化還原狀態(tài)要求較高。趨磁細(xì)菌由于能夠通過(guò)生物礦化合成磁性顆?！判◇w，所以可感受地磁場(chǎng)，在磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行定向游弋。磁小體在趨磁細(xì)菌體內(nèi)排列成鏈狀，而大大增大了菌體的總磁矩。磁小體結(jié)構(gòu)均一，性能穩(wěn)定，分散性好，在生物學(xué)、物理學(xué)、材料學(xué)上有非常

2、廣泛的應(yīng)用。
　　 磁小體作為趨磁細(xì)菌體內(nèi)一類特殊的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，其合成機(jī)制、作用機(jī)制引起了許多學(xué)者的研究興趣。目前已獲得的研究成果表明，磁小體合成是受一系列基因編碼產(chǎn)物的控制而完成的復(fù)雜過(guò)程。大致包括鐵源的吸收、運(yùn)輸、運(yùn)輸過(guò)程中的代謝以及價(jià)態(tài)變化，磁小體膜的起源和內(nèi)陷，磁小體晶核的生物礦化，以及成熟磁小體的鏈狀排列等等。這些過(guò)程互相影響、互相滲透，在不同種類的趨磁細(xì)菌中展示出多樣性和種屬特異性，涉及多種目前未曾全面了解的復(fù)雜生理活

3、動(dòng)和代謝途徑，且對(duì)環(huán)境因素影響敏感。同時(shí)，遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與磁小體合成的有關(guān)基因有明顯的結(jié)構(gòu)組成特征，以基因島的形式存在于趨磁細(xì)菌基因組中，在基因島內(nèi)又可分為幾個(gè)大的基因簇。島內(nèi)基因簇之間以及基因島兩端都存在正向重復(fù)序列，推測(cè)這些正向重復(fù)序列通過(guò)與某些相關(guān)重組蛋白的相互作用，會(huì)導(dǎo)致基因島以一定的頻率進(jìn)行重排，最終引起基因島序列部分或者全部的丟失，從而造成菌體磁小體合成能力的遺傳不穩(wěn)定性。
　　 綜上所述，磁小體合成過(guò)程可能會(huì)受到

4、菌體多種代謝途徑的影響。通過(guò)總結(jié)產(chǎn)磁過(guò)程中鐵源的代謝研究成果，我們推測(cè)菌體內(nèi)存在的反硝化蛋白組分可能與磁小體合成中鐵價(jià)態(tài)變化過(guò)程相偶聯(lián)。在趨磁細(xì)菌模式菌株MS-1(MagnetospirillummagnetotacticumMS-1)體內(nèi)鑒定出了反硝化組分——硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶。通過(guò)對(duì)兩種酶體外活性的研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽還原酶可能在微好氧條件下以及磁小體合成過(guò)程中的能量供應(yīng)方面起作用。而亞硝酸鹽還原酶具有一種與趨磁細(xì)菌相關(guān)的特異

5、活性:二價(jià)鐵:亞硝酸鹽氧化還原酶活性。推測(cè)該酶在反硝化途徑中參與了磁小體合成過(guò)程中鐵源的氧化還原?；谏鲜鰞煞N酶的初步研究，我們推測(cè)趨磁細(xì)菌在以硝酸鹽作為唯一氮源的培養(yǎng)條件下合成菌體所需蛋白質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)的同時(shí)，可偶聯(lián)鐵的氧化還原從而參與或影響磁小體合成過(guò)程。但是由于MS-1在厭氧條件下不能以硝酸鹽作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，所以目前還不能確定MS-1體內(nèi)有獨(dú)立的反硝化系統(tǒng)存在。趨磁細(xì)菌AMB-1是趨磁細(xì)菌研究的另一模式菌株，與MS-1不同的是，

6、其能夠在厭氧條件下以硝酸鹽為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)磁。
　　 作為兼性厭氧微生物，趨磁細(xì)菌在氧氣存在條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，但是氧在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧也同時(shí)會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用，這種作用主要表現(xiàn)在對(duì)蛋白、核酸等生物大分子的損傷。我們?cè)谮叴偶?xì)菌模式菌株，淡水趨磁螺菌AMB-1(MagnetospirillummagneticumAMB-1)中報(bào)道了三個(gè)過(guò)氧化還原酶，研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)诨钚匝踝杂苫那宄c磁小體合成能力遺傳穩(wěn)定性的維持方面發(fā)揮

7、重要作用。尤為重要的是這些酶組分的缺失會(huì)明顯提高菌體在傳代過(guò)程中基因組磁小體島的丟失頻率。因此，趨磁細(xì)菌的氧化抗逆性途徑可能在好氧條件下維持磁小體基因島遺傳穩(wěn)定性方面起作用，但是具體作用機(jī)制并不清楚。在趨磁螺菌MSR-1(Magnetospirillumgryphiswaldense)中，重組酶RecA可以通過(guò)重組活性參與磁小體基因島遺傳過(guò)程中大片段的丟失，是磁小體島遺傳不穩(wěn)定性的直接原因之一。
　　 本文以淡水趨磁螺菌AMB-

8、1為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)兩個(gè)方面進(jìn)行了研究。第一，AMB-1反硝化代謝途徑的分析鑒定以及功能驗(yàn)證?；趯?duì)趨磁細(xì)菌體內(nèi)鐵源代謝以及價(jià)態(tài)變化的推測(cè)，對(duì)AMB-1中反硝化途徑在細(xì)胞能量供應(yīng)和對(duì)磁小體合成過(guò)程的影響進(jìn)行了探討。第二，針對(duì)AMB-1的磁小體合成過(guò)程及可能的影響因素，通過(guò)轉(zhuǎn)座誘變對(duì)AMB-1進(jìn)行突變篩選，探索了磁小體島外與其生理代謝功能相關(guān)的基因在磁小體合成過(guò)程中的作用。通過(guò)對(duì)一個(gè)DNA損傷修復(fù)基因功能失活突變菌株的研究，探討了DNA損傷修

9、復(fù)系統(tǒng)在高氧化壓力的環(huán)境下對(duì)AMB-1磁小體基因島以及菌體產(chǎn)磁功能的影響。具體工作內(nèi)容和創(chuàng)新性研究結(jié)果如下:
　　 1.對(duì)AMB-1亞硝酸鹽還原酶的編碼基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能分析，探討了該酶在AMB-1反硝化代謝以及磁小體合成過(guò)程中的作用。
　　 通過(guò)AMB-1基因組的生物信息學(xué)分析，獲得了三個(gè)可能的亞硝酸鹽還原酶編碼基因:amb1395、amb1408、amb4165。在建立體外酶活測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，對(duì)該酶在菌體內(nèi)的活性分

10、布和產(chǎn)酶適宜條件進(jìn)行摸索。結(jié)果表明，亞硝酸鹽還原酶酶活在菌體靜置培養(yǎng)狀態(tài)下的周質(zhì)空間組分中分布較高。對(duì)靜置培養(yǎng)的AMB-1周質(zhì)空間組分進(jìn)行分離純化，得到電泳純的活性純蛋白組分。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，該蛋白的編碼基因?yàn)锳MB-1基因組中的amb1395。
　　 通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄分析表明，amb1395在靜置培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄水平明顯高于振蕩培養(yǎng)條件，并且在靜置培養(yǎng)條件下，amb1395的轉(zhuǎn)錄水平在磁小體合成階段明顯升高，說(shuō)

11、明該基因的表達(dá)產(chǎn)物與磁小體的合成密切相關(guān)。但采用單交換插入策略對(duì)amb1395進(jìn)行了功能失活后，功能失活突變株的生理表型卻顯示，菌體在厭氧條件下的生長(zhǎng)和磁小體合成與野生型相比均無(wú)明顯區(qū)別。這些結(jié)果表明，雖然該酶在趨磁細(xì)菌AMB-1的反硝化代謝及磁小體合成過(guò)程中不發(fā)揮主要作用，但可能參與了上述過(guò)程。另外，由于該酶的催化底物亞硝酸鹽對(duì)菌體有毒性，推測(cè)菌體內(nèi)應(yīng)該存在其他途徑組分能夠分解亞硝酸鹽，導(dǎo)致菌體在缺失amb1395之后沒(méi)有明顯的表型變

12、化。
　　 2.通過(guò)對(duì)AMB-1在不同氮源條件下的生長(zhǎng)以及對(duì)硝酸鹽還原酶基因的預(yù)測(cè)分析，確定了反硝化途徑對(duì)AMB-1在厭氧條件下的生長(zhǎng)及產(chǎn)磁過(guò)程的重要性。
　　 AMB-1能夠以硝酸鹽作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)。硝酸鹽在體內(nèi)可以通過(guò)銨化作用供應(yīng)菌體大分子物質(zhì)的合成。以銨鹽作為唯一氮源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明，菌體在好氧振蕩條件下能夠正常生長(zhǎng)，但是在靜置培養(yǎng)或者厭氧條件下生長(zhǎng)則受到明顯抑制，這說(shuō)明銨鹽在靜置或厭氧條件下不能完全代替硝酸鹽。

13、結(jié)合MS-1中的研究，可以推測(cè)在AMB-1體內(nèi)可能存在依賴于硝酸鹽的厭氧產(chǎn)能途徑。通過(guò)生物信息學(xué)分析，在AMB-1基因組中存在一個(gè)硝酸鹽還原酶編碼基因，amb2690。在建立其體外酶活測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，對(duì)amb2690進(jìn)行了插入失活。發(fā)現(xiàn)硝酸鹽還原酶功能失活突變株在以硝酸鹽作為唯一氮源的有氧培養(yǎng)條件下可正常生長(zhǎng)，但不能在厭氧條件下生長(zhǎng)和產(chǎn)磁。在以0.3L/min的流速通入空氣的恒定通氧發(fā)酵條件下，菌體能夠在獲得氧氣的基礎(chǔ)上進(jìn)行生長(zhǎng)，此時(shí)

14、菌體的鐵吸收水平和磁小體合成水平不受影響。這些結(jié)果說(shuō)明反硝化途徑可能僅在厭氧條件下作為趨磁細(xì)菌AMB-1生長(zhǎng)和磁小體合成過(guò)程的能量來(lái)源，與磁小體合成過(guò)程并沒(méi)有特異性的聯(lián)系。當(dāng)有氧氣存在時(shí)，反硝化途徑的功能喪失對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)磁過(guò)程沒(méi)有影響。
　　 3.DNA損傷修復(fù)體系UvrABC在好氧條件下具有維持AMB-1磁小體島遺傳穩(wěn)定性的重要作用。
　　 利用轉(zhuǎn)座子對(duì)AMB-1進(jìn)行隨機(jī)插入突變，獲得了一株產(chǎn)磁異常突變株。該突變株的

15、生長(zhǎng)與野生型AMB-1沒(méi)有明顯差別，但是磁小體合成能力明顯低于野生型。通過(guò)分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)該突變株的DNA損傷修復(fù)蛋白復(fù)合體UvrABC的UvrA亞基編碼基因uvrA被轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致其功能失活。進(jìn)一步對(duì)uvrA的定點(diǎn)插入失活研究表明，該組分的功能缺失使得菌體在恒定通氧發(fā)酵條件下的產(chǎn)磁能力受到不可逆的損傷。突變株經(jīng)過(guò)好氧培養(yǎng)后，保留產(chǎn)磁能力的菌體只占群體的38％左右（野生型AMB-1的產(chǎn)磁菌體達(dá)94％）。同時(shí)，產(chǎn)磁菌體的平均磁小體合成

16、數(shù)目也明顯降低，突變株平均為1-4個(gè)，遠(yuǎn)低于野生型的8-20個(gè)。通過(guò)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，突變株在好氧條件傳代過(guò)程中，磁小體島基因拷貝數(shù)與基因組其他區(qū)段基因拷貝數(shù)的比值明顯降低，突變株子代的磁小體島拷貝數(shù)在經(jīng)20次左右的傳代后僅為突變株原始菌株的20-30％，而同樣條件下的野生型AMB-1子代能保持初始菌株的80％。這表明突變株的磁小體島遺傳穩(wěn)定性在UvrA缺失的情況下明顯下降。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄分析表明，突變株中的重組酶基因recA轉(zhuǎn)錄水平

17、明顯高于野生型AMB-1，達(dá)到AMB-1的11.9倍。recA的插入失活可以降低因UvrA功能失活而引發(fā)的磁小體島區(qū)域的不穩(wěn)定性。因此，uvrA缺失菌中recA轉(zhuǎn)錄活性的上升可能是導(dǎo)致磁小體島遺傳穩(wěn)定性下降的原因。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為UvrABC體系的功能喪失會(huì)造成趨磁細(xì)菌在好氧條件下DNA隨機(jī)損傷的積累，這種損傷積累到一定水平能夠?qū)е禄赗ecA蛋白的同源重組修復(fù)途徑的激活而引發(fā)基因組磁小體島遺傳穩(wěn)定性的降低。該研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充和