基于微流控芯片激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)的研究與應(yīng)用.pdf

1、微全分析系統(tǒng)的研究是上世紀(jì)90年代所提出的全新概念。微流控芯片的加工以微電路加工技術(shù)為基礎(chǔ)，以單晶硅片為材質(zhì)。作為一種分析平臺(tái)，微流控芯片實(shí)驗(yàn)室主要以芯片毛細(xì)管電泳的形式開(kāi)始研究。隨著微加工技術(shù)的不同發(fā)展，微流控芯片實(shí)驗(yàn)室的研究已經(jīng)廣泛的涉及到了食品衛(wèi)生、藥物分離、環(huán)境分析、生化分析等幾乎所有的分析領(lǐng)域。微全分析系統(tǒng)已經(jīng)將化學(xué)分析領(lǐng)域所涉及到的各個(gè)單元集成在了非常小的芯片上，具有高通量，高精度，高速度的特點(diǎn)。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器是目前最靈

2、敏，應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)方法之一。因此也是與微流控芯片相匹配研究最多的檢測(cè)器。根據(jù)光學(xué)體統(tǒng)不同，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器可以分為共聚焦型檢測(cè)系統(tǒng)，非共聚焦型檢測(cè)系統(tǒng)和正交型檢測(cè)系統(tǒng)。
　　 本文基于微流控芯片電泳正交型激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的研制與改進(jìn)工作入手，完善了微流控芯片激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)的研究。將垂直檢測(cè)，改為側(cè)壁檢測(cè)，減小了整個(gè)分析系統(tǒng)體積；在光電倍增光前端放置了微型小孔，降低了激光器的噪聲，提高了信噪比與檢測(cè)靈敏度；開(kāi)發(fā)了一種新

3、型芯片定位技術(shù)，可以避免由于材料或加工芯片的厚度造成的芯片高度定位誤差，不需要人工的反復(fù)調(diào)整也不需要高成本、高技術(shù)的自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，保證每一塊芯片相對(duì)于光源高度的輕松、簡(jiǎn)單、正確定位。將分析對(duì)象通過(guò)嵌入劑或衍生化反應(yīng)產(chǎn)生熒光，考察了不同篩分介質(zhì)對(duì)DNA片段的篩分性能，檢測(cè)了一段p53基因的堿基突變，建立了分析牛奶中氨基酸含量的檢測(cè)方法等。從而實(shí)現(xiàn)了微流控芯片激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用。主要內(nèi)容包括：
　　 第一章簡(jiǎn)要地綜述了微流控

4、芯片實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展歷史、基本原理、分離模式、聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)、應(yīng)用領(lǐng)域、研究進(jìn)展以及本論文研究的目的和意義。
　　 第二章完善了一種集成化的、可用于微流控芯片電泳檢測(cè)的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)的研究。制備了蓋片、基片長(zhǎng)度不同的玻璃微流控芯片，并將芯片的側(cè)壁拋光，使儀器由垂直檢測(cè)改為側(cè)壁檢測(cè)，減少了儀器整體的體積；在光電倍增光前端放置了微型小孔，降低了激光器的噪聲，提高了信噪比與檢測(cè)靈敏度；并開(kāi)發(fā)了一種利用芯片健合面上，蓋片大于基片的部分作

5、為微流控芯片的定位面和支撐面的方法，結(jié)合彈簧壓片，實(shí)現(xiàn)了芯片的精確定位。以四觸點(diǎn)高電壓系統(tǒng)控制芯片上的進(jìn)樣和電泳分離操作。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)采用正交光路模式，對(duì)熒光染料Cy5的檢出限達(dá)到10-11mol/L(S/N=3)。
　　 第三章利用自由基反應(yīng)，制備了一種可以用于微流控芯片上快速篩分DNA片段的共聚物。將聚吡咯烷酮(PVP)和羥乙基纖維素(HEC)形成的共聚物作為篩分介質(zhì)成功的分離了DNA片段。通過(guò)改變PVP在聚合物中的

6、比列，在進(jìn)樣場(chǎng)強(qiáng)為600V/cm，共聚物摩爾比列為PVP:HEC為3:1時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)FX174-HaeⅢdigestDNA marke的進(jìn)樣分離分析，將72-1353 bp DNA片段總分離分析時(shí)間縮短為3min。樣品各片段的分離效率達(dá)到2.51×105m-1-3.89×105m-1。本研究為DNA片段的分離提供了簡(jiǎn)便、快速、靈敏的方法。
　　 第四章考察了金納米粒子與聚合物的復(fù)合體系對(duì)DNA marker的篩分性能。首先將不含

7、金納米粒子(GNPs)的聚合物混合溶液涂覆在芯片內(nèi)壁，然后在這一體系中加入不同粒徑大小的GNPs再次涂覆在通道內(nèi)壁，并作為篩分介質(zhì)，也可以成功的分離FX174-HaeⅢ digest DNA marker，大大提高檢測(cè)信噪比。研究發(fā)現(xiàn)，在簡(jiǎn)單超聲處理后，直接混合的聚合物溶液中，加入直徑大小為30nm的GNPs，可以在4分鐘以內(nèi)，實(shí)現(xiàn)樣品DNA片段分離檢測(cè)。樣品DNA各個(gè)片段遷移時(shí)間的RSD值均小于2.51％，分離效率最高8.54×104

8、m-1。本研究拓展了納米材料在微流控芯片電泳中的應(yīng)用。
　　 第五章利用微流控芯片電泳(ME)結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)(LIF)技術(shù)，根據(jù)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)原理，建立了檢測(cè)人類p53基因突變的方法。設(shè)計(jì)不同堿基長(zhǎng)度的p53單鏈序列，針對(duì)易突變的外顯子7，8，9進(jìn)行SSCP分析，分離正常與突變的單鏈DNA序列；研究了篩分介質(zhì)聚乙烯基氧化物(PEO)的濃度，場(chǎng)強(qiáng)對(duì)芯片電泳行為的影響。在PEO濃度為0.5％，分離場(chǎng)強(qiáng)為260V/c

9、m時(shí)，100s之內(nèi)就可以實(shí)現(xiàn)樣品p53外顯子7，8，9的正常型與突變型堿基的分離檢測(cè)。本研究為p53外顯子的突變檢測(cè)提供了快速、簡(jiǎn)單、靈敏的方法。
　　 第六章建立了一種用于測(cè)定牛奶中氨基酸成分的微流控芯片電泳-熒光檢測(cè)方法。以硼砂緩沖溶液為背景電解質(zhì)，經(jīng)紅敏熒光染料(Cy5)衍生的7種氨基酸在150s內(nèi)可以得到很好的分離和測(cè)定。考查了各個(gè)分離參數(shù)對(duì)分離的影響，得到的優(yōu)化條件為:100mmol/L硼砂-氫氧化鈉溶液(pH9.7)