基于DNA條形碼及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的燕窩鑒別研究.pdf

1、目的:
　　燕窩(Edible bird's nest，EBN)為雨燕科(Apodidae)金絲燕屬(Aerodramus或Collocalia)多種鳥類分泌唾液筑成的巢窩，主產(chǎn)于東南亞沿海地區(qū)。因燕窩屬于昂貴珍稀之物，價(jià)位等級(jí)懸殊，利潤豐厚，同時(shí)由于缺乏科學(xué)的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，致使目前市場上燕窩品種質(zhì)量參差不齊，許多不法商人利用全假或摻假燕窩及其制品謀取暴利的現(xiàn)象十分嚴(yán)重，目前燕窩鑒別的方法和技術(shù)雖已有一定的實(shí)用性，但專屬性和靈敏性還需

2、進(jìn)一步改進(jìn)和提高。因此為規(guī)范市場和合理開發(fā)使用，亟需對燕窩進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立一套科學(xué)有效的質(zhì)量評價(jià)方法。近年來，基于DNA測序和序列分析的DNA條形碼技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于中藥材的物種基原和真?zhèn)舞b定方面，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在快速、高效和高靈敏度方面具有更加獨(dú)特的優(yōu)勢。由于不同品種的燕窩是由不同物種的金絲燕所產(chǎn)，而且其價(jià)格和質(zhì)量差異巨大，為了更加全面地掌握不同品種和地理居群燕窩的生物基原，本項(xiàng)目收集了32種不同國家和

3、不同品種的燕窩商品，分別針對Cytb、ND2、COI、12S rRNA基因序列，利用DNA條形碼技術(shù)鑒別燕窩的基原，并探討不同種類燕窩的品質(zhì)分類關(guān)聯(lián)，為燕窩的品質(zhì)鑒定提供更為全面的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1.收集了來自不同產(chǎn)地（不同國家和省份）和品種（包括屋燕、洞燕、白燕、血燕等）的31種官燕窩和1種毛燕窩，用口腔/咽拭子基因組DNA提取試劑盒提取燕窩中總DNA，使用引物ND5（5'-TAGCTAGGATCTTTC

4、GCCCT-3'）和H15709（5'-GGCATATGCGAATARGAARTATCA-3'）進(jìn)行Cytb序列片段的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后，用ABI3730測序儀進(jìn)行雙向測序。通過美國國立生物信息中心(NCBI)上的BLAST服務(wù)器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在GenBank基因庫上進(jìn)行在線搜索下載樣品的相似序列，使用MEGA6.0中的ClustalW對樣品序列進(jìn)行比對，分析樣品的

5、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)等信息，Kimura2-parameter模型計(jì)算遺傳距離，采用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　2.利用上述鑒定了生物基原的32個(gè)燕窩樣品，根據(jù)數(shù)據(jù)庫下載的金絲燕序列設(shè)計(jì)引物，分別針對ND2、COI、12S rRNA基因序列片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用相似性搜索法(BLAST)、最近距離法(nearest distance)等對燕窩的物種進(jìn)行鑒定分析。利用軟件MEGA6.0中的ClustalW對樣品序列

6、進(jìn)行比對，分析變異位點(diǎn);利用Kimura2-parameter model計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Boostrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率;最終建立燕窩商品基原物種的Cytb、ND2、COI、12S rRNA條形碼序列。
　　3.根據(jù)序列分析找出在金絲燕屬中保守卻在其他物種中有差異的區(qū)域設(shè)計(jì)特異靶向金絲燕屬物種的引物和TaqMan探針，蛋白酶K法提取燕窩線粒體DNA，采用實(shí)時(shí)熒

7、光定量PCR技術(shù)對燕窩樣品進(jìn)行檢測，以提取純化后的正品燕窩基因組DNA為陽性標(biāo)準(zhǔn)品并稀釋至不同倍數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)品模板拷貝數(shù)的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;以人、鼠、雞、豬、魚、海帶等的線粒體DNA為陰性對照檢測其特異性;對不同濃度的燕窩DNA模板進(jìn)行檢測考察其敏感性;對三個(gè)濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品分別作5次重復(fù)檢測以考察該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　4.由于市場上多有將豬皮全部或部分摻入燕窩中的造假現(xiàn)象，

8、為了有效鑒別出燕窩樣品是否含有豬皮成分，借鑒食品方面檢測摻假的方法，本實(shí)驗(yàn)分別選用豬的通用引物擴(kuò)增其部分DNA序列，把豬皮分別按50％，30％，10％，5％，1％的比例摻入正品燕窩中，提取總DNA，進(jìn)行PCR，電泳檢測PCR產(chǎn)物并測序鑒定物種，以建立一種快速檢測燕窩中豬源成分的PCR方法。
　　結(jié)果:
　　1.將所得樣品序列拼接校正后經(jīng)MEGA軟件對齊刪減，最終選取所有樣品長度均為290bp的一段峰形規(guī)則的Cytb序列。BL

9、AST搜索結(jié)果顯示各個(gè)樣品相似性最高的前幾十條序列均為雨燕科金絲燕屬Aerodramus的物種，與其最相似序列的相似度均為100％。290bp的Cytb基因序列中，保守位點(diǎn)270個(gè)，保守位點(diǎn)占核苷酸總數(shù)的93.1％，變異位點(diǎn)20個(gè)，變異位點(diǎn)約占核苷酸總數(shù)的6.9％。K-2p遺傳距離計(jì)算結(jié)果顯示所有樣品之間的遺傳距離在0.000-0.062之間，從各樣品序列的遺傳距離和簡約信息位點(diǎn)來分析，32個(gè)樣品中將有三個(gè)基原物種的差異。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

10、結(jié)果顯示，23個(gè)樣品均與所有的爪哇金絲燕Aerodramus fuciphagus聚為一支，支持率為84％，確定其生物來源為爪哇金絲燕;8個(gè)樣品與所有的淡腰金絲燕Aerodramus fuciphagus germani聚為一支，支持率為74％，確定其生物來源為淡腰金絲燕;32號(hào)樣品與所有的大金絲燕Aerodramus maximus聚為一支，支持率為96％，但由于Genbank上所查詢的大金絲燕A.maximus和其亞種A.maxim

11、us lowi并未產(chǎn)生分支，因此認(rèn)為該樣品的生物來源為大金絲燕A.maximus或其亞種A.maximus lowi。
　　2.最終獲得樣品長度為124bp的一段ND2序列進(jìn)行分析。BLAST搜索結(jié)果顯示1-31號(hào)爪哇金絲燕和淡腰金絲燕所產(chǎn)的燕窩樣品的最相似序列均為爪哇金絲燕A.fuciphagus其中23個(gè)爪哇金絲燕燕窩樣品的最高相似度為100％，另8個(gè)淡腰金絲燕燕窩樣品的最高相似度為98％;32號(hào)大金絲燕所產(chǎn)的毛燕窩樣品的最相

12、似序列為大金絲燕A.maximus。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，1-31號(hào)所有樣品均與爪哇金絲燕A.fuciphagus聚為一支，支持率為62％;其中11、17、21、22、23、25、26、28號(hào)樣品與其他樣品又另分為一支，支持率為82％;32號(hào)樣品與所有的大金絲燕A.maximus聚為一支，支持率為72％。將所有燕窩樣品和Genbank下載的相關(guān)物種124bp的該段ND2序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示淡腰金絲燕A.fuciphagus germ

13、ani與爪哇金絲燕A.fuciphagus存在2個(gè)簡約信息位點(diǎn)，大金絲燕A.maximus的序列與爪哇金絲燕相比具有10個(gè)簡約信息位點(diǎn)，而金絲燕屬不同物種之間各自具有多個(gè)變異位點(diǎn)。
　　3.最終選取29個(gè)燕窩樣品長度為179bp的一段COI序列進(jìn)行分析， BLAST搜索及NJ系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，關(guān)于燕窩樣品的生物基原和Cytb及ND2序列的鑒定結(jié)果完全一致，所有淡腰金絲燕所產(chǎn)的燕窩樣品單獨(dú)聚為一支，支持率為79％。COI序列比對結(jié)

14、果顯示淡腰金絲燕A.fuciphagus germani與爪哇金絲燕A.fuciphagus存在2個(gè)簡約信息位點(diǎn)，大金絲燕A.maximus的序列與爪哇金絲燕相比具有9個(gè)簡約信息位點(diǎn)。
　　4.最終選取22個(gè)燕窩樣品長度為560bp的一段I2S rRNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果所有燕窩樣品的生物基原和上述Cytb、ND2及COI序列的鑒定結(jié)果完全一致，所有淡腰金絲燕所產(chǎn)的燕窩樣品單獨(dú)聚為一支，支持率為84％。12S rRNA序列比對結(jié)果

15、顯示在該段序列上，爪哇金絲燕種群內(nèi)有1個(gè)簡約信息位點(diǎn)，淡腰金絲燕與其相比有5個(gè)簡約信息位點(diǎn)，大金絲燕與其他兩個(gè)物種相比有25個(gè)簡約信息位點(diǎn)，而且有一堿基缺失。這一結(jié)果提示該段條形碼對于鑒別金絲燕不同物種具有更多的參考信息。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)目的基因PCR產(chǎn)物大小約270bp，測序驗(yàn)證為爪哇金絲燕的Cytb序列;陽性標(biāo)準(zhǔn)品在3.7×107copies/μL-3.7×103copies/μL

16、濃度拷貝數(shù)范圍內(nèi)和相對應(yīng)的CT值之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.964，線性關(guān)系方程式為:CT=-3.38(copy number)+16.304。特異性檢測結(jié)果顯示，不同來源和批次的燕窩樣品均有擴(kuò)增曲線，而人、鼠、雞、魚、海帶等的線粒體DNA未見擴(kuò)增曲線，表明所設(shè)計(jì)Cytb基因引物探針的特異性良好;加樣量模板濃度在3.7×103copies/μL時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR仍然有擴(kuò)增，說明具有良好的靈敏度，可檢測痕量的燕窩樣品。
　

17、　6.含不同比例豬皮的燕窩樣品進(jìn)行PCR之后的電泳檢測結(jié)果顯示，豬皮陽性對照在130bp的地方有一明顯條帶，測序驗(yàn)證為豬的序列片段;摻不同比例豬皮的燕窩樣品均在豬條帶同一位置出現(xiàn)條帶，不摻豬皮的正品燕窩在該位置無條帶。結(jié)果證明該方法可以有效地檢測燕窩中是否摻入豬源成分。
　　結(jié)論:
　　本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了市場上的官燕窩的生物基原為爪哇金絲燕A.fuciphagus或其亞種A.fuciphagus germani，毛燕窩的生物

18、基原為大金絲燕A.maximus或其亞種A.maximus lowi;不同顏色、不同形狀的燕窩商品，在生物基原上并無規(guī)律性;不同產(chǎn)地的燕窩與文獻(xiàn)記載金絲燕的分布基本一致;洞燕大多是爪哇金絲燕的亞種淡腰金絲燕A.fuciphagus germani，而屋燕多是原種爪哇金絲燕A.fuciphagus。關(guān)于商品燕窩種類及產(chǎn)地在基因上的差異，尚須收集更多的燕窩樣品來驗(yàn)證。
　　本文所建立的Cytb、ND2、COI、12S rRNA序列條形

19、碼均可用于快速、準(zhǔn)確鑒別燕窩的基原物種，并探索了Genbank中尚未報(bào)道的爪哇金絲燕亞種淡腰金絲燕A.fuciphagus germani的ND2、COI和12S rRNA序列片段。但由于Genbank有關(guān)金絲燕的數(shù)據(jù)信息和燕窩樣品種類方面的限制，未能鑒別爪哇金絲燕的其它亞種，也未能將大金絲燕A.maximus和其亞種A.maximus lowi鑒別開來。
　　本文所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性、靈敏性、重復(fù)性