基于細(xì)菌纖維素天然微結(jié)構(gòu)的功能復(fù)合材料及其關(guān)鍵制備技術(shù)研究.pdf

1、細(xì)菌纖維素（Bacterial nano-cellulose，簡稱為BNC）是一種由微生物所分泌纖維素納米絲構(gòu)成的獨特水凝膠。天然BNC水凝膠的納米纖維網(wǎng)絡(luò)微結(jié)構(gòu)類似于細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）的膠原蛋白絲骨架，同時其還具備高含水、高生物相容性、富羥基表面、高生物活性等諸多優(yōu)良特性，這使得其被認(rèn)為是一種天生的理想生物醫(yī)用材料，在燒傷敷料、人工血管及骨組織支架等諸多的生物醫(yī)用領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。B

2、NC的諸多優(yōu)秀特性（如促進(jìn)傷口愈合的生物活性、高含水持水特性等），極其依賴其與生俱來的納米纖維網(wǎng)絡(luò)微結(jié)構(gòu)。該微結(jié)構(gòu)形成于其特殊的微生物制造過程，其纖維素纖維在纖維細(xì)度、聚合度、高度均一性及立體堆砌結(jié)構(gòu)等特性上，是現(xiàn)有人工技術(shù)難以達(dá)到的。然而，天然的BNC材料仍受到自身原始材料特性的局限，尚不能滿足某些特定應(yīng)用的功能性要求。特別是：（1）高含水態(tài)凝膠強度和耐縫合強度較低；（2）不具備抗菌特性（3）BNC水凝膠在常規(guī)干燥（風(fēng)干、熱干燥等）失

3、水后形成的干膠，難以通過再次復(fù)吸水實現(xiàn)體積再溶脹。（4）除了天然材料性能上的不足之外，傳統(tǒng)BNC靜態(tài)生產(chǎn)模式，低效、周期長的缺陷極大地限制其工業(yè)化放大生產(chǎn)。
　　現(xiàn)有復(fù)合功能化手段通常會破壞天然BNC原本的獨特微結(jié)構(gòu)與特性，從而極大地影響了BNC復(fù)合材料的應(yīng)用效能。如何利用與保護(hù)BNC的自身原本的微結(jié)構(gòu)和特性，獲得保留BNC天生結(jié)構(gòu)特性的功能增強材料，是BNC水凝膠基復(fù)合材料生產(chǎn)技術(shù)研究的關(guān)鍵問題。在本研究中，保存與恢復(fù) BNC水

4、凝膠天然微結(jié)構(gòu)特性被作為設(shè)計BNC功能增強復(fù)合材料的首要考慮因素，并開展了以下四個方面的研究：
　　首先，針對BNC水凝膠基體在高含水態(tài)下強度不足及耐縫合特性弱的缺陷，采用內(nèi)骨架增強方式保持BNC水凝膠基體原有天然功能與結(jié)構(gòu)，并同時實現(xiàn)材料整體結(jié)構(gòu)強度增強。傳統(tǒng)紡織醫(yī)用紗布雖然存在保水、透氣、促愈功能性不足，但是結(jié)構(gòu)強度較好，且具有較為可靠的生物安全性，是較為理想的內(nèi)骨架材料。本研究以醫(yī)用棉質(zhì)紗布（Cotton gauze,簡稱C

5、G）作為織物骨架模型，制備了織物骨架增強的BNC復(fù)合材料并對材料的基本理化特性進(jìn)行了表征。以動態(tài)掛膜方式，研究制備了三種不同凝膠涂層厚度的 BNC-CG骨架增強材料，并將其與CG及靜態(tài)培養(yǎng)10天的BNC膜進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該動態(tài)方式生產(chǎn)的BNC-CG材料的BNC凝膠涂層均一性高，能夠?qū)G骨架完整對稱的包裹。同時保持了 BNC原本的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及水凝膠屬性。與靜態(tài)培養(yǎng)的BNC水凝膠相比，其含水率有明顯下降，但是仍然超過了98％。在

6、機械性能方面，通過CG骨架增強， BNC基體的拉伸強度及縫合強度均提高了兩個數(shù)量級；而對于 CG材料，即使僅有少量的BNC凝膠涂覆，其絕對斷裂強度和吸水能力即能得到極大提高，同時降低斷裂伸長率。該結(jié)果表明，織物骨架增強BNC材料的技術(shù)，能夠在保留BNC原本屬性的基礎(chǔ)上極大增強強度可靠性；另一方面，對于傳統(tǒng)紗布材料來說，表面涂覆BNC凝膠也是一種極佳的織物特性改造手段，將極大提升傳統(tǒng)紡織紗布的醫(yī)用特性及生物相容性水平。與單純的 BNC凝膠

7、或者 CG材料相比， BNC-CG復(fù)合材料在醫(yī)用敷料材料領(lǐng)域具有更好的應(yīng)用前景。
　　其二，針對傳統(tǒng)細(xì)菌纖維素靜態(tài)生產(chǎn)方式低效的缺陷，同時也為了實現(xiàn)既不破壞BNC基體結(jié)構(gòu)，又能完成BNC內(nèi)的織物骨架植入，本文提出構(gòu)建一種新的水平旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器，探索了在BNC高效生物制造過程中實現(xiàn)材料復(fù)合的動態(tài)掛膜式生產(chǎn)工藝。以一種類似于“凝膠涂層”的生物膜生長過程，將BNC凝膠平整涂覆于織物骨架上，形成織物增強的BNC復(fù)合材料。詳細(xì)比較研究了動態(tài)

8、掛膜方式與傳統(tǒng)靜態(tài)方式下BNC的培養(yǎng)歷程。結(jié)果表明：該動態(tài)掛膜方式能夠?qū)鹘y(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)的10天成膜周期縮短至3天。該動態(tài)生長方式通過改善靜態(tài)培養(yǎng)過程的關(guān)鍵控制性因素（即其營養(yǎng)物——糖的傳質(zhì)）提高細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)效率。但是，實驗顯示該方式下，培養(yǎng)基內(nèi)的菌群濃度并未明顯提高，且兩種方式的糖利用率、殘余糖濃和 BNC總產(chǎn)量并未明顯變化。為進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)過程，研究比較了傳統(tǒng)靜態(tài)生產(chǎn)方式與水平旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器的傳質(zhì)差異，并基于菲克第二定律，建立生物膜的動

9、態(tài)糖擴散模型，對動態(tài)掛膜方式的糖傳質(zhì)過程及其對BNC生產(chǎn)的影響機制進(jìn)行了系統(tǒng)闡釋。該模型顯示，糖傳質(zhì)過程受到糖本身的擴散系數(shù)（糖分子決定）、擴散時間（轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)速和裝液體積共同決定）、培養(yǎng)基的糖濃度等三個因素決定。單個轉(zhuǎn)鼓周期中，糖向菌膜內(nèi)擴散的滲透距離由轉(zhuǎn)速（擴散時間）和擴散系數(shù)共同決定，而不受培養(yǎng)基中的殘余糖濃度的影響。通過熒光染色法對菌膜內(nèi)的菌群分布情況進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)在離生物膜界面約100μm內(nèi)存在類似于靜態(tài)培養(yǎng)氣液界面有氧區(qū)的富菌

10、群區(qū)域。研究初步闡明了如何通過水平轉(zhuǎn)鼓反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速調(diào)控糖傳質(zhì)過程，繼而影響B(tài)NC生產(chǎn)效率的影響機制：即糖通量的擴散距離過短，會使得有氧區(qū)的菌體無法得到充足的糖補充；而過長的糖通量擴散距離，會使得糖通量擴散進(jìn)入菌體處于休眠或抑制狀態(tài)下的無氧區(qū)內(nèi)，因而無法被有效利用。通過不同糖類的轉(zhuǎn)速優(yōu)化實驗和同種糖類的轉(zhuǎn)速差速優(yōu)化比較實驗證實了該影響機制。據(jù)我們所知，這是首次對動態(tài)掛膜方式下生產(chǎn)BNC中糖傳質(zhì)影響機制的闡釋。與傳統(tǒng)方式相比，采用水平轉(zhuǎn)鼓式

11、生物反應(yīng)器的動態(tài)掛膜生產(chǎn)方式更易于實現(xiàn)工業(yè)化放大生產(chǎn)，具有良好的商業(yè)化應(yīng)用前景。
　　其三，針對BNC材料自身不具備抗菌特性的不足，本研究通過先在培養(yǎng)基中溶解與纖維素親和性好的抗菌功能高分子，再采用原位復(fù)合法，以實現(xiàn)功能高分子在BNC納米纖維絲的胞外組裝過程中摻入纖維素納米纖維內(nèi)部，形成兩種高分子復(fù)合的納米纖維絲。該復(fù)合方式可以實現(xiàn)在保留BNC天然微結(jié)構(gòu)、含水特性及凝膠特性的同時，使其獲得抗菌功能性。本研究以具備良好生物相容性及抗

12、菌特性的殼聚糖（Chitosan，CS）作為功能性高分子，并使CS分子在BNC納米纖維“生物組裝”的過程中摻雜入BNC納米纖維內(nèi)部，繼而進(jìn)一步通過培養(yǎng)，交織成具備BNC天然微結(jié)構(gòu)的CS/BNC復(fù)合納米纖維網(wǎng)絡(luò)基體。為實現(xiàn)CS在BNC納米纖維中的高濃度水平摻雜，研究首先采用靜態(tài)培養(yǎng)方式下的原位培養(yǎng)復(fù)合，對影響CS摻雜水平的培養(yǎng)基的溶解酸種類、pH條件和滅菌方式進(jìn)行了篩選及優(yōu)化。結(jié)果顯示，采用混合后同步滅菌的乙酸CS原位培養(yǎng)基，能夠較好實現(xiàn)

13、CS/BNC的原位復(fù)合目標(biāo)。CS不僅能成功摻雜入納米纖維的內(nèi)部形成CS/BNC復(fù)合納米纖維，而且在苛刻的堿煮純化后仍能穩(wěn)定存在，CS含量可達(dá)復(fù)合材料干重的35%-48%。但是，靜態(tài)原位培養(yǎng)技術(shù)也暴露出摻雜的抗菌功能材料會抑制BNC生產(chǎn)菌自身合成纖維素活性的缺陷。這導(dǎo)致了靜態(tài)培養(yǎng)條件下，即便在培養(yǎng)基中添加低濃度水平的 CS，其菌體的納米纖維生產(chǎn)量都會極大地下降，且所獲得的BNC納米纖維網(wǎng)絡(luò)交織密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未添加CS的對照組，所形成的CS/

14、BNC膜非常薄，強度甚至不能滿足基本力學(xué)測試的要求，更無法實際應(yīng)用。為此，進(jìn)一步采用已構(gòu)建的水平轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器，通過動態(tài)掛膜方式進(jìn)行原位復(fù)合培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在動態(tài)方式下，菌體具有較高的活性和對抗抗菌高分子的能力，能夠耐受0.25-0.75 w/v%的CS，生產(chǎn)出與未添加CS對照組相當(dāng)?shù)哪z厚度的BNC/CS復(fù)合凝膠膜。其中CS/BNC復(fù)合材料的CS占到材料干重的40-44%。動態(tài)生產(chǎn)的CS/BNC復(fù)合凝膠保留了 BNC原本的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

15、，平均直徑仍然低于100μm，且其纖維密度接近正常對照組，但是受到CS的摻雜濃度水平提高的影響，納米纖維直徑的均一度會降低，直徑分布范圍變寬。通過抗菌測試發(fā)現(xiàn)，動態(tài)掛膜法生產(chǎn)的CS/BNC復(fù)合材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抗菌能力，且主要表現(xiàn)為靜態(tài)接觸條件下的抑菌性。該動態(tài)生產(chǎn)的CS/BNC復(fù)合材料不僅保持了BNC原本的類ECM納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而且具備抑菌和織物骨架增強特性，因此在BNC醫(yī)用復(fù)合材料領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。<

16、br>　　最后，由于BNC水凝膠在常規(guī)干燥后無法像多數(shù)高分子水凝膠一樣，通過復(fù)吸水再次溶脹恢復(fù)成水凝膠，并且其三維納米纖維網(wǎng)絡(luò)微結(jié)構(gòu)在干燥坍塌后也無法自主恢復(fù)，論文對BNC微結(jié)構(gòu)的復(fù)水恢復(fù)能力進(jìn)行了改進(jìn)研究。雖然天然BNC水凝膠失水后幾乎無法復(fù)水，但是相比于其他高分子水凝膠在溶脹或退溶脹時表現(xiàn)為各個方向尺寸上（各向同性或各向異性）的三維變化，BNC水凝膠由于獨特的分層式納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在干燥收縮時幾乎僅沿著自身厚度方向一維收縮。而無支

17、撐、高溶脹的一維溶脹水凝膠膜一直是水凝膠及工程材料領(lǐng)域多年求之不得的一種概念上的水凝膠元件，其難以實現(xiàn)的原因在于：已知的現(xiàn)有水凝膠材料或者結(jié)構(gòu)，在無約束狀態(tài)下未能實現(xiàn)大尺度一維體積變化。因此，解決BNC復(fù)水及微結(jié)構(gòu)自主恢復(fù)的問題，不僅能夠改善天然BNC的性能缺陷，同時也提供了一種制備無支撐一維溶脹水凝膠膜的可能。本論文提出在BNC納米纖維網(wǎng)絡(luò)中穿插聚電解質(zhì)（Polyelectrolyte，PE）的復(fù)合方案：利用 PE穿插于BNC納米纖維

18、網(wǎng)絡(luò)及沉積于BNC納米纖維表面，使得干燥后層層堆積及互相聚集的BNC納米纖維被PE分子相互隔離；通過PE分子在特定pH下電離產(chǎn)生的靜電斥力，可使BNC納米纖維聚集體相互分開，從而啟動其納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)恢復(fù)及復(fù)水溶脹。為證實該設(shè)想，論文分別選擇了三種不同類型的PE分子作為研究對象，即陽離子氨基的殼聚糖，具陰離子羧基的羧甲基纖維素，及兼具陰陽離子的羧甲基殼聚糖，分別制備了三種類型各異的PE/BNC復(fù)合膜，并對其pH響應(yīng)的溶脹特性及其一維溶脹

19、性能進(jìn)行了驗證研究。該PE/BNC復(fù)合膜是一類具有pH響應(yīng)、無支撐、大溶脹率的一維溶脹薄膜材料；其可以在30 min內(nèi)，從不到10-20μm迅速溶脹至數(shù)個毫米；同時在其厚度膨脹約100倍的過程中，該膜的平面尺寸維持不變。另外，本研究以苯甲酸作為模型分子，通過垂直雙室擴散池測定了小分子對PE/BNC膜的透過性能。結(jié)果表明該膜具備在溶脹狀態(tài)下接近于零階的控釋性能，而在非溶脹狀態(tài)下能夠讓小分子快速透過。PE/BNC復(fù)合膜是世界上目前僅有的幾種