RNA去甲基化酶FTO抑制劑對小鼠精原細(xì)胞增殖的調(diào)控研究.pdf

1、精子發(fā)生包括精原細(xì)胞的增殖與分化，減數(shù)分裂和精子細(xì)胞的變形成熟等過程，受到轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾和非編碼RNA等表觀調(diào)控因子調(diào)控。近期研究表明m6A是真核生物mRNA上最豐富的一種化學(xué)修飾，參與調(diào)控mRNA剪接，降解以及翻譯等代謝過程，從而調(diào)控基因的表達(dá);另據(jù)報(bào)道，m6A修飾參與精子發(fā)生的調(diào)控。FTO作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，通過調(diào)控m6A修飾水平參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化，癌細(xì)胞的增殖。MA2作為甲氯芬那酸(meclofenami

2、c acid，MA)的乙酯形式，可以有效的競爭性結(jié)合到FTO的活性中心，從而抑制FTO的m6A去甲基化酶活性。為探究m6A修飾對精原細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，本研究選擇小鼠B型精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞之間階段來源的GC-1spg細(xì)胞作為研究對象，采用western blot、qRT-PCR、細(xì)胞流式、EdU、m6A dot blot等方法研究m6A對GC-1spg細(xì)胞增殖的調(diào)控作用;此外，構(gòu)建雙熒光報(bào)告系統(tǒng)并驗(yàn)證m6A報(bào)告質(zhì)粒的功能。獲得結(jié)果如

3、下：
　　1、MA2處理不影響FTO蛋白的表達(dá)，mRNA的m6A修飾水平在MA2處理后顯著上調(diào)，并且m6A修飾水平的增加與MA2處理濃度呈正相關(guān)。
　　2、MA2處理導(dǎo)致GC-1spg細(xì)胞活性的降低，多核細(xì)胞數(shù)目的增加，但是TUNEL陽性細(xì)胞比例沒有改變;同時(shí)，Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3，Bax和Bcl2的蛋白表達(dá)無顯著變化。
　　3、MA2處理GC-1spg細(xì)胞導(dǎo)致EdU陽性細(xì)胞比例

4、的下降，和增殖標(biāo)記基因PCNA和ki67表達(dá)的下調(diào)。另外，MA2處理誘導(dǎo)GC-1spg細(xì)胞周期G1/S阻滯。
　　4、查詢在線數(shù)據(jù)庫(http://mirlab.sysu.edu.cn/rmbase/)得到含有m6A修飾的細(xì)胞周期調(diào)控基因;進(jìn)一步的檢測表明MA2處理上調(diào)CDK8的表達(dá)，但是下調(diào)CDK1，CDK2,CDK7,CDK9和CDK12的mRNA表達(dá)。
　　5、針對CREBBP基因3'UTR區(qū)的3個(gè)m6A修飾位點(diǎn)成功構(gòu)

5、建了CREBBP-m6A報(bào)告系統(tǒng)，結(jié)果表明細(xì)胞中mCherry的熒光強(qiáng)度與m6A修飾水平呈負(fù)相關(guān)。構(gòu)建了CDK2基因3'UTR m6A修飾位點(diǎn)的熒光報(bào)告質(zhì)粒，并驗(yàn)證了CDK23'UTR區(qū)的m6A修飾可以調(diào)控CDK2轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。
　　綜上，通過FTO抑制劑MA2處理GC-1spg細(xì)胞，增加精原細(xì)胞中mRNA的m6A修飾，并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S阻滯，抑制細(xì)胞增殖。此外，建立了以CREBBP-m6A報(bào)告