基于轉(zhuǎn)錄組分析的PUB蛋白與甘藍(lán)S-位點(diǎn)受體激酶的相互作用研究.pdf

1、自交不親和（Self-incompatibility，SI）是顯花植物防止自交、促進(jìn)雜交，保持物種遺傳多樣性的重要機(jī)制之一。甘藍(lán)等蕓薹屬（Brassica）植物屬于典型孢子體型自交不親和植物，其自交不親和性由S位點(diǎn)（S-locus）上的復(fù)等位基因所控制。當(dāng)自花授粉時(shí)，花粉落到柱頭上，花粉中SCR可與柱頭上SRK胞外域識(shí)別并特異性結(jié)合，引起SRK構(gòu)象的變化和自體磷酸化，使其釋放結(jié)合在SRK激酶結(jié)構(gòu)域的類(lèi)硫氧還蛋白1/2（THL1/2），隨

2、后ARC1結(jié)合到SRK胞內(nèi)激酶域上，并被磷酸化，ARC1是E3泛素連接酶，通過(guò)泛素化作用向下繼續(xù)傳導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)，最終導(dǎo)致自交不親和。最近研究表明，在琴葉擬南芥（Arabidopsis lyrata）中通過(guò)反義抑制柱頭內(nèi)的ARC1基因表達(dá)，只能部分地打破材料的不親和性；在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，ARC1直系同源基因是假性遺傳因子，僅僅轉(zhuǎn)入SRK-SCR基因后，擬南芥植株也能呈現(xiàn)出自交不親和性。由此說(shuō)明ARC1可

3、能并非SRK唯一的下游信號(hào)蛋白，柱頭內(nèi)可能存在其他未知底物與SRK作用，在柱頭內(nèi)繼續(xù)傳遞SI信號(hào)。在甘藍(lán)自花授粉的過(guò)程中，柱頭內(nèi)PUB蛋白的活性急劇增高，由此我們推測(cè)柱頭內(nèi)可能存在其他的泛素蛋白與 SRK作用，因此前期對(duì)甘藍(lán)高代自交不親和A4的花期柱頭做了自花授粉0 min和自花授粉30 min兩種處理，提取了柱頭總RNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)25條表達(dá)差異明顯的PUB蛋白基因。我們挑取了4條表達(dá)差異最為明顯的PUB蛋白進(jìn)行后續(xù)研究

4、，分別命名為 BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11；隨后，運(yùn)用qRT-PCR篩選出自花授粉后甘藍(lán)柱頭內(nèi)基因表達(dá)水平發(fā)生變化的PUB蛋白。參照PUB蛋白基因的同源序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以甘藍(lán)A4 cDNA為模板來(lái)擴(kuò)增基因片段，構(gòu)建T載體克隆并測(cè)序。為探究這些泛素蛋白能否 SRK發(fā)生相互作用，我們利用酵母雙雜交技術(shù)和 GST pull-down技術(shù)檢測(cè)PUB蛋白和SRK胞內(nèi)域之間的相互作用。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴在

5、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中，甘藍(lán)柱頭經(jīng)過(guò)自花授粉0 min與自花授粉30 min兩種處理，BoSU03、BoSU05、BoSU07的基因表達(dá)量上升，BoSU11的基因表達(dá)量下降。為更精確的探究自花授粉后甘藍(lán)柱頭中泛素蛋白的時(shí)空表達(dá)特異性，我們以未授粉、自花授粉15 min、30 min、60 min的柱頭cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自花授粉后，ARC1的表達(dá)量有所下降，同時(shí)BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoS

6、U11的基因表達(dá)量相較于未授粉時(shí)也都在下降。我們注意到，BoSU11在熒光定量PCR中的基因表達(dá)量變化與在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中變化趨勢(shì)一致，但是BoSU03、BoSU05、BoSU07的基因表達(dá)量在熒光定量PCR中是下降的，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)變化趨勢(shì)不一致，這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組和熒光定量分析時(shí)獲取自花授粉0 min柱頭的時(shí)間點(diǎn)存在差異所導(dǎo)致。但是自花授粉后BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11的基因差異表達(dá)進(jìn)一步說(shuō)明

7、了BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11可能響應(yīng)了自花授粉后柱頭內(nèi)的自交不親和反應(yīng)。⑵根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的PUB基因片段序列，結(jié)合蕓薹屬基因數(shù)據(jù)庫(kù)和甘藍(lán)基因數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因引物。我們對(duì)BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11的全長(zhǎng)CDS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成；這4個(gè)PUB蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)；在線分析這些泛素蛋白的理化性質(zhì)和功能性位點(diǎn)，這4個(gè)PU

8、B蛋白氨基酸序列都含有多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、cAMP或cGMP依賴性磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和酪蛋白Ⅱ磷酸化位點(diǎn)等功能性位點(diǎn)；BoSU07、BoSU11和ARC1一樣不僅具有ARM臂重復(fù)結(jié)構(gòu)，還含有U-box結(jié)構(gòu)域；但是BoSU03、BoSU05僅含有ARM臂重復(fù)結(jié)構(gòu)域，而不具備U-box結(jié)構(gòu)域。⑶因?yàn)镾RK的胞內(nèi)域與ARC1的U-box結(jié)構(gòu)域之間沒(méi)有相互作用，而與其ARM臂重復(fù)結(jié)構(gòu)域之間存在相互作用，故設(shè)計(jì)引物時(shí)摒除了泛素蛋白的

9、U-box區(qū)段，并在引物上下兩端分別加入限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建甘藍(lán)泛素蛋白基因、ARC1和SRK的酵母表達(dá)載體：pGADT7-BoSU03、pGADT7-BoSU05、pGADT7-BoSU07、pGADT7-BoSU11、 pGADT7-ARC1、pGBKT7-SRK，通過(guò)毒性檢測(cè)和自激活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的表達(dá)載體對(duì)酵母細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，也沒(méi)有自激活作用；將PUB蛋白、ARC1的酵母表達(dá)載體分別和pGBKT7-SRK共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)AH1

10、09，觀察共轉(zhuǎn)化酵母在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol3-AT固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)，以此檢測(cè)這些泛素蛋白與SRK之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11、和ARC1與SRK的組合在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol3-AT固體培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，且顯現(xiàn)出藍(lán)色反應(yīng)，表明BoSU03、BoSU05、BoSU07、

11、BoSU11可能與SRK發(fā)生相互作用。⑷依據(jù)共沉淀法鑒定蛋白質(zhì)相互作用原理，通過(guò)研究 Promega蛋白純化試劑盒原理來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)間相互作用的檢測(cè)。利用 pET43.1a作為表達(dá)載體表達(dá)BoSU07和BoSU11，利用pET43.1a-BoSU07、pET43.1a-BoSU11融合蛋白序列中的6×His標(biāo)簽與 Ni+結(jié)合，結(jié)合的復(fù)合物作為誘餌蛋白，把體外表達(dá)的pGEX-4T-1-SRK融合蛋白作為靶蛋白，pET43.1a-BoSU07

12、、pET43.1a-BoSU11上結(jié)合的Ni+，孵育后利用其與磁力架吸附性將誘餌蛋白和靶蛋白的復(fù)合體純化出來(lái)。SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果顯示，pET43.1a-BoSU07和pET43.1a-BoSU11融合蛋白都能夠與pGEX-4T-1-SRK融合蛋白相互結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體，而與Ni+一起被洗脫下來(lái)，表明BoSU07、BoSU11都能與SRK胞內(nèi)域發(fā)生相互作用。我們推測(cè)BoSU07、BoSU11作為PUB蛋白家族成員，很有可能通過(guò)與S