高效家蠶絲腺生物反應器的關鍵因素分析.pdf

1、家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表，作為第二大模式昆蟲，它不僅有著重要的研究價值，而且可以帶來可觀的經(jīng)濟價值。轉基因技術的成功建立是生命科學領域的里程碑，它頻繁的被用于改變生物的性狀以及通過這種技術在生物體中表達一些珍貴的外源蛋白。PiggyBac轉座子是最具吸引力的轉座原件之一，它已經(jīng)廣泛的被應用于十多種生物的研究。PiggyBac轉座子介導的轉基因技術為家蠶的轉基因研究提供了堅實的基礎。家蠶絲腺有著驚人的蛋白合成和分泌的能力，是一種非常理想

2、的生物反應器。經(jīng)過數(shù)十年的努力，研究人員已經(jīng)創(chuàng)建了家蠶中部和后部絲腺生物反應器。這些生物反應器已經(jīng)成功表達了數(shù)十種外源蛋白。然而，現(xiàn)有的家蠶絲腺生物反應器效率依舊不高，主要體現(xiàn)在piggyBac轉座子介導的轉基因效率低、外源蛋白表達量較低、以及理想的轉基因陽性個體篩選較復雜等等，這幾個問題成為了建立高效家蠶絲腺生物反應器所面臨的最大障礙。因此，提高轉基因效率、提高外源基因表達量以及創(chuàng)建一種快速外源基因高效表達的轉基因陽性個體篩選方法顯得

3、尤為重要。本文就針對這些科學問題展開了一系列的研究，取得的主要成果歸納如下:
　　1、類轉錄激活因子效應蛋白介導piggyBac轉麈子的商效轉座
　　針對piggyBac介導的轉基因效率不高這個問題，本研究創(chuàng)建了一種有效提高轉座效率的新方法，該方法的核心是構建一個類轉錄激活因子效應蛋白（transcription activator-like effector，TALE）和piggyBac轉座酶（PBase）的融合蛋白（TA

4、LE-PBase）。實驗證明TALE-PBase融合蛋白可以顯著地將轉座效率提高到63.9％，這相當于是目前轉座效率平均水平的7倍。而且新方法的轉基因陽性蛾區(qū)中的陽性個體數(shù)每區(qū)平均達到近18條，比目前家蠶轉基因實驗的平均水平最大提高了5.7倍。TALE-PBase融合蛋白介導的轉基因技術不僅提高了轉基因陽性蛾區(qū)數(shù)，而且也明顯提高了陽性蛾區(qū)中的陽性個體數(shù)。這兩方面的提高是piggyBac轉座子介導的轉基因技術的巨大突破，為今后的轉基因研究

5、提供了很好的技術支撐。
　　2、家蠶絲膠1啟動子的結構與活性分析
　　啟動子是調控目的基因時空表達重要的調控原件之一。然而，絕大多數(shù)的研究將目光放在了核心啟動子或近端啟動子區(qū)域，而近端啟動子5'端的序列常常被人們所忽視。本研究就4kb長度的家蠶絲膠1（sericin1，Ser1）啟動子序列通過生物信息學方法預測到種類眾多的潛在的轉錄因子結合位點，采用轉基因實驗發(fā)現(xiàn)啟動子序列包含的轉錄因子結合位點越多且種類越豐富時，啟動子的轉

6、錄活性就越強大。但是重復的近端啟動子多個拷貝組合并不能提高下游基因的轉錄水平，而且重復的近端啟動子拷貝數(shù)越多，下游基因的轉錄水平反而越低。結果說明，4kb長度的Ser1啟動子要比其短的啟動子活性要高，重復的近端啟動子多個拷貝組合并不能提高下游基因轉錄活性。這個結果為今后構建高效家蠶絲腺生物反應器時選擇合適長度的啟動子提供了參考。
　　3、PiggyBac轉座子在家蠶基因中的定向轉座
　　轉座子的隨機轉座時常不利于外源基因的表

7、達，而且可能會引起內源基因的突變。TALE-PBase融合蛋白介導的轉座理論上有可能實現(xiàn)定向轉座。PBase通過TALE靶向蛋白的牽引到達目的位點，從而在目的位點實現(xiàn)定向轉座。通過研究我們發(fā)現(xiàn)了TALE-PBase介導的轉座改變了piggyBac轉座子原先完全隨機插入的特性，而是變的更加具有傾向性，但還沒有得到真正定向轉座的結果。我們還在71個轉座家蠶中發(fā)現(xiàn)了2對插入位點一樣的家蠶，這種現(xiàn)象在常規(guī)的piggyBac轉座研究中是非常罕見的

8、。由此可見，TALE對PBase在一定程度上起到了靶向引導作用，這為今后在個體水平實現(xiàn)定點轉座提供了寶貴的參考價值。
　　4、TALEN介導的家蠶同源重組
　　家蠶受精卵相當于家蠶的早期個體，相比細胞，它更能反應生命的真實情況。因此，用家蠶受精卵進行同源重組(homologous recombination，HR)實驗可以反應個體水平同源重組的發(fā)生概率。同源重組精確的基因組編輯能力可以彌補其它基因組打靶技術的不足，而且也可以

9、解決piggyBac轉座子隨機插入基因組這一問題。但同源重組的低效率現(xiàn)象是阻礙其廣泛應用的一個限制因素。本研究采用蠶卵為材料，將TALEN mRNA和供體同源重組質粒注射到產(chǎn)卵8h的家蠶受精卵內，經(jīng)72 h后進行TALEN打靶效率的鑒定以及同源重組效率的檢測，結果發(fā)現(xiàn)TALEN在顯微注射后72h就已經(jīng)對靶位點產(chǎn)生了明顯突變，在檢測的15組樣品中有12組出現(xiàn)了明顯打靶，打靶效率達到80％。并且在15組受精卵中成功檢測到3組包含陽性的同源重

10、組個體，同源重組效率達到20％。這種蠶卵早期的TALEN打靶效率以及同源重組效率的檢測可以在短期內評判實驗的可行性，為后續(xù)陽性同源重組個體的篩選提供保障。同時也證明采用TALEN mRNA和供體同源重組質粒組合可以實現(xiàn)精確的基因組編輯。
　　5、外源基因表達效率的輔助檢測
　　雖然piggyBac轉座子是以隨機的方式插入基因組，但是將外源基因表達框和標志基因表達框以相同轉錄方向緊密的構建在一起時，我們相信印使在不同的插入位點

11、，兩個表達框受到來自基因組的影響是相近的。我們構建了螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)Luc）和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，EGFP）兩個相鄰的基因，作了轉錄水平的相關分析，結果表明即使插入位點不同，這兩個基因的轉錄水平總是顯著相關的。ELISA實驗進一步顯示EGFP的轉錄水平和翻譯水平同樣也是顯著相關。所以，外源基因的表達水平可以通過檢測標志基因(EGFP)的表達水平來簡單的