家蠶絲腺生物反應器表達hGM-CSF轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及應用研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori），又名桑蠶，屬鱗翅目家蠶蛾科，是迄今為止數(shù)百萬種昆蟲中僅有的被馴化并大規(guī)模人工飼養(yǎng)的經(jīng)濟昆蟲。其幼蟲具有一對發(fā)達的絹絲腺，能夠大量合成分泌絲蛋白。近幾年，以轉(zhuǎn)基因家蠶表達外源蛋白的技術體系正被逐步建立。但現(xiàn)有的技術體系存在外源基因表達量不高，篩選工作量大等問題。 本研究以絲蛋白基因啟動子構(gòu)建新的基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶轉(zhuǎn)基因載體。克隆絲素蛋白重鏈基因（fibroin heavy chain，

2、fib—H）、輕鏈基因（fibroin light chain，fib—L）啟動子，并以生物信息學手段分析啟動子元件：構(gòu)建fib—H、fib—L啟動子控制紅色熒光蛋白（Discosoma red fluorescent protein，DsRed/drFP583）報告基因的瞬時表達載體，進行家蠶體內(nèi)及BmN培養(yǎng)細胞中的瞬時表達試驗；構(gòu)建分別以fib—H、fib—L啟動子控制外源基因的轉(zhuǎn)基因載體；以piggyBac轉(zhuǎn)座子介導進行家蠶培養(yǎng)細

3、胞的轉(zhuǎn)基因研究；以構(gòu)建完成的轉(zhuǎn)基因載體初步進行家蠶轉(zhuǎn)基因研究。 研究結(jié)果獲得了fib—H啟動子（EF540776，489 bp）、fib—L啟動子（EF540777，606 bp），fib—L來源的polyA加尾信號序列（EF216676，289 bp），fib—L第一內(nèi)含子來源的增強子序列（enhancer）（DQ679478，375 bp），新霉素抗性基因（neomycin resistance gene，neor）等元件；

4、瞬時表達證明克隆的啟動子在家蠶后部絲腺組織具有特異性活性，同時發(fā)現(xiàn)其在家蠶卵巢來源的BmN培養(yǎng)細胞中亦具有一定的活性；以克隆的元件構(gòu)建二種新的轉(zhuǎn)基因載體，除了已有的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報告基因外，載體中包括分別以fib—H、fib—L啟動子控制外源功能基因hGM—CSF（humangranulocyte—macrophage colony stimulating factor，粒/巨

5、噬細胞集落刺激因子）并帶有polyA加尾信號的表達元件、促進轉(zhuǎn)錄活性的增強子元件、可與GFP進行雙重篩選的neor基因表達元件；以帶有neor基因表達元件和GFP報告基因的piggyBac轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)化家蠶BmN細胞，以終濃度800μg/mL的G418（Geneticin）篩選3個月，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞，呈現(xiàn)綠色熒光細胞數(shù)約75%，PCR鑒定證實細胞基因組DNA中外源基因的存在；構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體初步進行家蠶轉(zhuǎn)基因試驗，幼蟲2齡3d觀察到3