內(nèi)蒙古西部地區(qū)蜱傳克里米亞剛果出血熱病毒基因組和分子流行病學(xué)研究.pdf

1、蜱蟲作為一種重要的媒介生物，其種類繁多、分布廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)了83種蜱傳病毒，其中不乏嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生的蜱傳腦炎病毒、科羅拉多蜱傳熱病毒等。尤其是2007年蜱媒非洲豬瘟暴發(fā)和國(guó)內(nèi)2009年發(fā)現(xiàn)蜱媒“新型布尼亞病毒”致人死亡事件發(fā)生以來，蜱傳病毒的研究引起了國(guó)內(nèi)外專家和國(guó)家疾病防控部門的高度重視。內(nèi)蒙古是畜牧業(yè)集中地帶，伴隨而來該地區(qū)有大量的蜱蟲寄生，以動(dòng)物為中介，蜱很容易將病毒傳播給人類和其它動(dòng)物，使得該地區(qū)是蜱傳病毒病的潛在高危地區(qū)。

2、因此，為了充分保障該地區(qū)牧民生命安全和畜牧業(yè)的健康發(fā)展，填補(bǔ)我國(guó)內(nèi)蒙地區(qū)蜱蟲攜帶病毒的本底數(shù)據(jù)的空白，調(diào)查是否具有重要人獸共患病相關(guān)的病毒并進(jìn)行深入研究，本研究采集內(nèi)蒙古左旗和右旗地區(qū)的動(dòng)物寄生蜱蟲，利用病毒宏基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)蜱傳病毒進(jìn)行研究，通過實(shí)驗(yàn)，獲得以下結(jié)果:
　　(1)樣品采集:本實(shí)驗(yàn)樣品采集工作于2015-2016年間完成。2015年5月，于內(nèi)蒙古自治區(qū)的阿拉善盟左旗和阿拉善盟左旗與右旗交界2個(gè)采樣點(diǎn)采集駱駝、綿羊體

3、表寄生的亞洲璃眼蜱共計(jì)643只;2016年4月，從內(nèi)蒙左右旗交界的駱駝，嘉鎮(zhèn)烏蘭呼都格嘎查采集的綿羊及駱駝血清，共計(jì)112份。
　　(2)樣品核酸檢測(cè):利用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)從所采集的樣品進(jìn)行病毒組學(xué)研究，共獲得了644692條Reads，拼接出2484條Contig。通過核酸序列注釋發(fā)現(xiàn)，其8.2％(203/2484)的contig為病毒序列，并注釋到4個(gè)病毒科和4個(gè)病毒屬;其中一條720bp的contig注釋到克里米亞剛果出

4、血熱病毒(CCHFV)，根據(jù)這條contig設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，共計(jì)從60個(gè)蜱蟲樣本中檢測(cè)到有4個(gè)樣本攜帶有克里米亞剛果出血熱病毒基因，四株病毒分別命名為N5株，H1株，NM-18株和NM-24株，其中H1株的宿主為綿羊，其余三株的宿主為駱駝，陽(yáng)性率為6.7％(4/60)。
　　(3)克里米亞剛果出血熱病毒全基因組研究:本研究通過NCBI Blast比對(duì)選擇參考株對(duì)其中一株病毒(NM-18株)的全序列進(jìn)行了分段擴(kuò)增

5、，共設(shè)計(jì)了18對(duì)簡(jiǎn)并引物，并擴(kuò)增出病毒的全基因組序列，其中包括S片段1672bp，ORF為1449bp，編碼482個(gè)氨基酸，Gc含量為45.25％;M片段5368bp，ORF為5070bp，編碼1689個(gè)氨基酸，Gc含量為43.60％;L片段12155bp，ORF為11838bp，編碼3945個(gè)氨基酸，Gc含量為41.37％。與已知的克里米亞剛果出血熱病毒進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，NM-18株與其他克里米亞剛果出血熱病毒相比，S片段的全基因

6、組序列同源性與同樣分離自我國(guó)蜱蟲的HY-13株最高，可以達(dá)到95.2％;M片段的全基因組核苷酸同源性則與分離自南非的SPU415/85株最高，可以達(dá)到91.2％;L片段的全基因組核苷酸同源性與同樣分離自我國(guó)蜱蟲的YL04057株同源性最高，可以達(dá)到93.7％。
　　(4)樣品血清學(xué)檢測(cè):本實(shí)驗(yàn)利用本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增出的NM-18株克里米亞剛果出血熱病毒的S片段，使用原核表達(dá)將病毒的N蛋白成功表達(dá)，大小為54kD，并成功純化，又利用純化成功

7、的克里米亞剛果出血熱病毒的N蛋白對(duì)來自內(nèi)蒙地區(qū)共計(jì)2個(gè)采樣點(diǎn)，2種蜱蟲宿主共112份血清進(jìn)行了Western blot檢測(cè)，在采集的全部112份血清中，克里米亞剛果出血熱病毒陽(yáng)性血清共有49份，陽(yáng)性率可以達(dá)到43.75％。
　　綜上所述，本研究通過病毒宏基因?qū)W技術(shù)次對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)的蜱蟲病毒組的研究，發(fā)現(xiàn)了蜱傳重要人獸共患病病原克里米亞剛果出血熱病毒的存在，成功的擴(kuò)增出一株克里米亞剛果出血熱病毒的全基因組序列，分析了宿主動(dòng)物對(duì)該病毒的